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背景和目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种影响老年人群认知和行为功能的神经退行性疾病。近年来针对AD核心致病物质β-淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）和Tau的治疗性抗体研究收效甚微,部分原因是在于给予干预时间较晚,患者脑内已经产生了显著的神经元丢失。上述治疗性研究的失败促使人们找寻新的AD的治疗靶点。神经元凋亡是AD病理的终末环节,与患者认知密切相关,因此神经元凋亡可能是AD的潜在治疗靶点。B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）调节蛋白家族是主要的细胞凋亡调节蛋白。与Bcl-2相互作用的细胞死亡介质（Bcl-2-interacting mediator of cell death,Bim）是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白,在包括中枢神经系统在内的人体组织中广泛表达并且介导由Aβ诱导的神经元凋亡。动物研究发现,Bim的表达,而不是Bcl-2家族的其他促凋亡蛋白,在AD小鼠模型的大脑中选择性地增加。尸检也证实Bim在AD患者大脑中特异性升高。这些发现都表明在AD的神经元凋亡中,Bim起着关键作用。新近的一项研究筛选出一系列在AD患者体内发生改变的自身抗体,这表明自身的体液免疫异常可能参与到AD的发病机制当中,其中就包括抗Bim自身抗体（Naturally occurring antibodies against Bim,NAbs-Bim）。此外,血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）的通透性在衰老过程中增加,从而为自身抗体进入大脑发挥病理生理作用提供了可能。因此,本研究拟探讨AD患者体内NAbs-Bim的水平变化情况,及其在AD病理发生与发展过程中的功能。材料和方法1.AD患者血浆NAbs-Bim水平的变化特点研究方案经陆军特色医学中心伦理审查委员会批准。本研究从陆军特色医学中心神经内科招募了55名AD患者和28名非AD痴呆患者。同时从陆军特色医学中心健康检查中心纳入了70名认知正常（Cognitively normal,CN）受试者。患者、受试者或其合法亲属均同意入组、并签署书面知情同意书。AD的诊断依据2018版NIA-AA标准并经匹兹堡B型化合物正电子发射断层扫描（Pittsburgh B compound positron emission tomography,Pi B-PET）阳性确认。通过免疫印迹确认受试者血浆中NAbs-Bim的存在。使用酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）来检测血浆NAbs-Bim水平,比较其在各组间的水平,并分析其水平与受试者迷你精神状态检查（Mini-mental state examination,MMSE）评分、Pi B-PET标准摄取值比率（Standard Uptake Value Ratio,SUVR）、血浆Aβ42、Aβ40和总Tau蛋白水平的相关性。2.NAbs-Bim对AD小鼠认知功能的影响（1）NAbs-Bim的给药:将8月龄的AD小鼠随机分为给药组和对照组。对于给药组,通过小鼠大脑立体定位注射技术向小鼠右侧侧脑室注射5μL NAbs-Bim,对照组注射等量的PBS。上述操作每周进行一次,共计持续4周。（2）行为学测试:将上述小鼠饲养至9月龄,对给药组、对照AD小鼠组以及年龄、性别匹配的野生型WT小鼠进行Y迷宫和旷场等行为学测试。在Y迷宫新臂实验中,记录小鼠进入新臂的次数和所占比例。在旷场实验中,记录探索总距离、贴壁、理毛次数和中心与外周时间比。行为学测试采用ANY-maze软件,并由计算机记录运动轨迹。3.NAbs-Bim对AD小鼠脑内Aβ病理的影响（1）取材:麻醉小鼠,采集小鼠眼动脉血液样本1.5 m L,随即用含0.1%Na NO2的生理盐水进行灌注,取对照组和给药组AD小鼠的大脑组织并进行称重。右脑半球用于免疫组化检测,左脑半球用于生化分析。（2）NAbs-Bim特异性检测:利用免疫荧光技术分别使用针对Bim、神经元胞体的NAbs-Bim、Neu N抗体和DAPI检测NAbs-Bim与神经元的结合;将重组Bim蛋白,无关蛋白（Aβ42）和白蛋白与Bim蛋白的混合物经上样、电泳、转膜后,分别用单克隆Bim抗体,NAbs-Bim孵育NC膜,扫膜并分析NAbs-Bim对外源性Bim蛋白的特异性;将小鼠脑粉蛋白经上样、电泳、转膜后,分别用单克隆Bim抗体,NAbs-Bim和无关Ig G孵育NC膜,扫膜并分析NAbs-Bim对内源性Bim蛋白的特异性。（3）免疫组织化学染色及分析:使用针对人源性Aβ特异性抗体6E10检测小鼠脑内总Aβ斑块数目和阳性面积比,采用刚果红染色进一步明确致密Aβ斑块数目和阳性面积比。（4）免疫印迹:利用含酶抑制剂的裂解液提取脑粉内的蛋白质,经上样、电泳、转膜后,用人源性Aβ特异性抗体6E10,171610、22c11、抗BACE1、ADAM10和PS1抗体、抗IDE、NEP、LRP1和RAGE抗体、抗Bim、BAX和BAK抗体、抗β-actin抗体孵育NC膜,扫膜并分析。4.NAbs-Bim在体外对Bim诱导的神经元凋亡和APP的淀粉样蛋白剪切途径的影响（1）NAbs-Bim的处理:首先将SH-SY5Y-APP695细胞分为三组,分别给予Bim蛋白、Bim蛋白加NAbs-Bim和PBS的处理;接着再将SH-SY5Y-APP695细胞分为三组,分别予以NAbs-Bim、si RNA-Bim和PBS处理。（2）线粒体染色:使用线粒体染色试剂对上述六组不同处理的细胞进行染色,荧光显微镜下观察并检测每组细胞线粒体数目及细胞活性情况。（3）CCK-8检测:使用CCK-8试剂对上述六组不同处理的细胞进行细胞增殖-毒性检测,使用酶标仪于450nm波长处检测吸光度。（4）细胞免疫荧光共染:利用免疫荧光技术使用针对Bim蛋白的抗体检测NAbs-Bim、si RNA-Bim和PBS处理的SH-SY5Y-APP695细胞中Bim蛋白的表达情况。（5）免疫印迹:利用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取不同处理组细胞内的蛋白质,经上样、电泳、转膜后,用人源性Aβ特异性抗体6E10,171610、22c11、抗BACE1、ADAM10和PS1抗体、抗IDE、NEP、LRP1和RAGE抗体、抗Bim、BAX和BAK抗体、抗β-actin抗体孵育NC膜,扫膜并分析。5.NAbs-Bim对AD小鼠脑内其他AD病理的影响（1）免疫组织化学和免疫荧光染色:分别使用针对小胶质细胞、星形胶质细胞和磷酸化Tau蛋白的CD68、GFAP和p T231-Tau抗体检测小鼠脑内活化小胶质细胞、星形胶质细胞和p T231阳性神经元;同时利用免疫荧光技术分别使用针对突触、神经元胞体和凋亡小体的Map-2、Neu N和Caspase-3抗体检测小鼠脑内突触密度、神经元和凋亡小体数目。（2）免疫印迹:将提取的脑粉蛋白经上样、电泳、转膜后,用抗总Tau蛋白和不同磷酸化位点的Tau蛋白抗体、抗PSD93、PSD95、Snap、SYN1和VAMP1抗体、抗β-actin抗体孵育NC膜,扫膜并分析。结果1.AD患者血浆中的NAbs-Bim水平降低（1）AD患者血浆中NAbs-Bim水平显著低于CN组。（2）所有受试者血浆中NAbs-Bim水平与认知功能评分MMSE呈正相关。（3）AD与非AD痴呆患者血浆中NAbs-Bim水平与Pi B-PET SUVR呈负相关。（4）AD与非AD痴呆患者血浆中NAbs-Bim水平与血浆Aβ42水平呈正相关,而与血浆Aβ40和t-Tau水平不相关。上述结果表明NAbs-Bim与AD严重程度呈负相关,可能具有保护作用。2.NAbs-Bim可以改善AD小鼠的行为认知缺陷（1）Y迷宫测试:Y迷宫新臂实验中NAbs-Bim处理组与WT小鼠表现一致,相较于对照组AD小鼠都有更多进入新壁的次数;但是在自发探索实验中三组小鼠没有展现出明显不同的表现。表明NAbs-Bim处理组小鼠有更好的空间识别能力。（2）旷场测试:NAbs-Bim处理组与WT小鼠相较于对照组AD小鼠均表现出更远的移动距离、更多的贴壁和理毛次数以及更高的中心区域与外周区域时间比。表明NAbs-Bim可以使AD小鼠活动增强,焦虑行为减少。上述结果表明NAbs-Bim可以改善AD小鼠的空间认知、运动能力和焦虑行为,提示NAbs-Bim有助于改善AD模型小鼠的认知和行为缺陷。3.NAbs-Bim可以减轻AD小鼠脑内Aβ病理（1）NAbs-Bim、Neu N和DAPI的免疫荧光共染表明NAbs-Bim能够与神经元细胞膜相结合。同时,以单克隆Bim抗体作为阳性对照,NAbs-Bim能识别重组Bim、重组Bim和白蛋白混合物中的Bim蛋白,但不能识别无关蛋白（Aβ42）。此外,以单克隆Bim抗体作为阳性对照,以不相关的Ig G作为阴性对照,我们发现NAbs-Bim也能够与内源性Bim相结合。（2）与对照组AD小鼠相比,NAbs-Bim处理组与对照组AD小鼠的新皮质和海马区域的总Aβ斑块面积和斑块密度没有显著差异;在致密Aβ斑块中,NAbs-Bim处理组小鼠新皮质区域的阳性斑块面积百分比显著减少,海马区域则没有差异,两个区域的斑块密度也不存在差异。（3）与对照组AD小鼠相比,NAbs-Bim处理组小鼠脑匀浆中APP的淀粉样蛋白剪切途径产物Aβ、CTF-β和s APPα+β水平显著降低。在NAbs-Bim处理的小鼠中,APP的淀粉样蛋白加工酶BACE1和Aβ在血脑屏障的内向转运蛋白RAGE的水平明显下降,总Bim蛋白、细胞外Bim蛋白、BAX和BAK的水平也明显下降。上述结果表明NAbs-Bim能与Bim蛋白特异性结合,并且NAbs-Bim可能是通过抑制APP的的淀粉样蛋白剪切途径减少Aβ的产生,从而减轻AD小鼠脑内Aβ病理。4.NAbs-Bim在体外拮抗Bim诱导的神经元凋亡和APP的淀粉样蛋白剪切途径（1）与对照组及NAbs-Bim+Bim蛋白处理组相比,Bim蛋白处理组线粒体染色阳性面积百分比和通过CCK-8检测的细胞活性均显著降低。（2）与对照组及NAbs-Bim+Bim蛋白处理组相比,Bim蛋白处理组细胞蛋白中的Aβ、CTF-β和s APPα+β水平显著增加,剪切酶BACE1水平也显著增加。（3）与对照组相比,NAbs-Bim处理组Bim阳性面积百分比均显著性降低,但高于si RNA-Bim处理组。NAbs-Bim和si RNA-Bim处理组线粒体染色阳性面积百分比显著高于对照组,且这两组间不具有差异。此外,CCK-8检测显示NAbs-Bim处理组的细胞活性显著高于对照组,但低于si RNA-Bim处理组。（4）与对照组相比,NAbs-Bim和si RNA-Bim处理组细胞蛋白中的Aβ、CTF-β和s APPα+β水平显著降低;剪切酶BACE1以及内向转运蛋白RAGE的水平也显著减少;Bim蛋白和Bim下游蛋白BAX、BAK水平也显著下降。上述结果表明,细胞外的Bim蛋白可以同时促进神经元的凋亡和APP的淀粉样蛋白剪切途径。NAbs-Bim可以通过拮抗细胞外Bim蛋白的病理效应从而在AD中发挥保护神经元的功能。5.NAbs-Bim可以减轻AD小鼠脑内其他AD病理（1）与对照组AD小鼠相比,NAbs-Bim处理组小鼠新皮质和海马区域的活化小胶质细胞均显著降低。（2）与对照组AD小鼠相比,NAbs-Bim的处理显著减少了小鼠海马区域的p T231阳性神经元的面积百分比;同时NAbs-Bim处理组小鼠脑匀浆中的总Tau蛋白与磷酸Tau蛋白的水平相较于对照组均显著降低。（3）与对照组AD小鼠相比,NAbs-Bim处理组小鼠海马区域Neu N和Map-2阳性面积百分比显著增加,Caspase-3阳性面积百分比显著减少。（4）与对照组AD小鼠相比,NAbs-Bim处理组小鼠脑匀浆中突触相关蛋白PSD95显著性增加。上述结果表明NAbs-Bim能够减轻AD小鼠脑内Tau病理、神经炎症、神经元凋亡水平同时改善突触退化情况,起到保护神经元的作用。结论在本研究中,我们发现AD患者血浆中的NAbs-Bim水平下降并且与AD的严重程度呈负相关。NAbs-Bim缓解了AD小鼠的认知行为缺陷,并减轻了该小鼠脑内Aβ沉积和其他AD病理。NAbs-Bim减少Aβ的产生可能是基于对APP的淀粉样蛋白剪切途径的抑制。综上,NAbs-Bim是天然的AD保护因子,AD患者体内NAbs-Bim水平的降低可能推动疾病的进展,Bim是潜在的AD治疗靶点。