论文部分内容阅读
查阅文献并通过Entrez检索NCBI数据库(www.ncbi.nih.nlm.gov)，搜集目前已知的东亚钳蝎基因组基因序列，将获得的基因组基因序列存为FASTA格式的文本文件。逐个将基因组基因序列附加进入ClustalX1.83软件，运行多序列联配，生成多序列联配文件。利用MEGA软件，将由ClustalX1.83软件生成的多序列联配文件转换为MEGA文件，进行编辑后输出，构建neighbor joining(NJ)树。从结果来看，神经毒素结构与功能密切相关，Na~+通道神经毒素和K~+通道神经毒素构成了无根树的两个主要的树枝，Ca2~+通道神经毒素位于K~+通道神经毒素树枝的边缘，而Cl~-通道神经毒素隐藏在K~+通道神经毒素的树枝中。以东亚钳蝎为原料，用蛋白酶K消化细胞，再用酚、氯仿除蛋白质，最后用乙醇沉淀DNA。以提取的东亚钳蝎DNA为模板，PCR扩增AGAP2成熟肽基因，将所获得的PCR产物进行电泳，将目的片段胶回收，双酶切后连于同样粘性末端的pET28a中，连接产物转化E．coli DH5α感受态细胞，涂板于卡那霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。挑选阳性重组菌落，经LB液体培养基培养12h后，提取质粒进行PCR扩增验证后，选出含有目的片段的阳性菌落，采用SSCP法筛选出有差异的菌落。测序后确定AGAP2的基因组基因序列，从琼脂糖宁焦点用和测序结果来看，AGAP2成熟肽编码区中没有内含子存在。这是基因组基因成熟肽编码区没有内含子的又一个例证。