第一部分:非编码RNA在双酚A致小鼠精母细胞凋亡中的表达谱改变【目的】分析非编码RNA在双酚A致小鼠精母细胞凋亡中表达谱的改变,分析其参与的重要通路和相关分子,寻找进一步研究的靶标。【方法】采用不同浓度的BPA对小鼠精母细胞系GC-2细胞进行染毒,对照组为0.1%DMSO溶剂组处理的GC-2细胞,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测细胞活性,探索BPA处理对GC-2细胞在半抑制浓度IC50。选择接近于IC50的120μM浓度对细胞进行染毒,检测细胞DNA复制能力和凋亡率。对BPA 120μM处理48 h后以及对照组的细胞进行收集,提取RNA。将样品分为三份,分别进行circular RNA(circ RNA),micro RNA(mi RNA)和m RNA测序,测序深度为10G。circ RNA、mi RNA和m RNA测序深度分别为10G、10M和6G。差异表达的circ RNA母基因的和m RNA的GO和KEGG分析采用R语言的Bioconductor包进行分析,并用ggplot包进行图形可视化输出。差异mi RNA参与生物学功能和信号通路分析是基于其靶基因,是用DIANA mi RPath v.3.0网站分析mi RNA靶基因参与的GO和KEGG通路。与circ RNA结合的mi RNA预测采用基于mi Randa 2010和RNAhybrid-2.1.2程序的circ Mir1.0软件进行。在GEO数据库下载BPA处理GC-2细胞后Cp G甲基化芯片数据集(GSE:79075),与我们的circ RNA和m RNA测序数据进行联合分析,分析启动子甲基化水平与circ RNA和m RNA改变的相关性。应用mi RTar Base v.8数据库导出经其他研究者已通过实验验证的mi RNA的靶基因。采用Cytoscape软件基于软件预测和实际测序结果构建circ RNA-mi RNA-靶基因m RNA互作网络图。【结果】经过48 h不同浓度的BPA处理后,GC-2细胞的活性呈剂量依赖性下降。IC50约介于120μM和160μM之间。DNA复制功能检测和流式细胞学凋亡率检测显示120μM能显著降低GC-2细胞的DNA复制能力和增加其凋亡率。高通量测序显示经过120μM的BPA处理后GC-2整体的RNA转录水平较对照组有所升高,在BPA处理后circ RNA、mi RNA和m RNA的类型数量以及表达水平在整体上有所升高,表达升高的RNA分子多于表达受抑制的分子。GO和KEGG分析显示差异大于两倍的circ RNA母基因以及mi RNA靶基因富集于细胞增殖,细胞凋亡,DNA损伤,DNA修复等通路。但是以同样标准筛选出的我们测序数据中的差异表达的m RNA却不像筛选出的circ RNA的母基因那样富集到功能通路,提示在相同的处理条件下circ RNA可能较其母基因更敏感地作出反应。对circ RNA及其母基因在我们测序数据中的m RNA的结果进行共表达分析发现,circ RNA的表达倍数通常较其母基因m RNA表达差异倍数更大,而且两者表达相关性不大,提示二者共转录可能性较小。对甲基化芯片和我们的测序数据进行分析发现,启动子甲基化水平改变与circ RNA改变相关性不大,提示circ RNA的差异受其启动子甲基化水平改变影响的可能性较低。与精子发生的相关circ RNA如circ Dmnt1,circ Kitl,circ Scmh1,circ Top2a,circ Clasp2在BPA暴露后发生显著改变。同时,与生精功能相关的mi RNA如mi R-15b,mi R-18a,和mi R-34家族以及雌激素通路相关mi RNA发生明显改变。大量功能性m RNA在BPA处理后也发生明显改变,如Sycp3,Meiob,Kit等减数分裂相关基因在BPA处理后显著下调,减数分裂起始调控因子Sohlh1和Sohlh2也发生明显改变。印记基因H19和Igf2在BPA处理后表达量下调两倍以上。与DNA甲基化相关的基因如Dnmt1,Dnmt3a和Dnmt3b在实验剂量BPA120μM处理下未见改变。【结论】BPA处理引起GC-2细胞的凋亡,并激活细胞的RNA转录水平,引起大量与细胞增殖和凋亡相关的circ RNA,mi RNA参与细胞的凋亡,提示BPA导致的生精细胞的凋亡受非编码RNA在表观遗传水平上的调控。第二部分circ RNA的验证以及功能筛选研究【目的】对差异表达显著的circ RNA进行验证,并批量构建过表达质粒筛选潜在有功能的circ RNA进行进一步的功能研究。【方法】将筛选标准制定为差异倍数大于两倍,P值小于0.05。对筛选得到的circ RNA设计针对“反向剪切”片段的引物特异性地扩增circ RNA,并采用Sanger测序验证扩增产物的正确性。q PCR定量检测验证测序结果的准确性。同时设计针对相应基因线性m RNA的引物,检测circ RNA对应的m RNA在对照组,120μM以及160μM BPA处理后的变化,比较两者的变化趋势差异。选择符合测序结果,且类型为外显子型的circ RNA批量构建过表达载体。构建策略为使用商业化的circ RNA过表达载体p LCDH-ci R以酶切连接或同源重组的方式构建。检测转染circ RNA后细胞活力的情况,筛选出有功能的circ RNA做进一步研究。【结果】circ RNA测序数据中差异大于两倍,P值小于0.05的circ RNA一共有25个,对其中12个设计特异性引物,均可扩出单一明亮条带。q PCR定量发现其中11个符合测序趋势。这些circ RNA对应母基因的m RNA在BPA处理下大多表达趋势和circ RNA一致,但是circ RNA表达倍数更高,特别是在高剂量组(160μM)中circ RNA的反应程度较相应的m RNA更大。在对其中的7个设计过表达载体,效率检测发现均有两倍以上的过表达,其中circ Dcbld2、circ Mapk1、circ Tbcld20过表达效率较高。这7个载体转染细胞后,采用CCK-8方法检测细胞活性,发现circ Dcbld2,circ Mapk1,circ Mpp6和circ Tbcld20可以促进细胞增殖,circ Usp3可抑制细胞增殖,circ Cnot6l和circ Ppm1b对细胞增殖无明显作用。对过表达效率较高的三个circ RNA载体circ Dcbld2,circ Mapk1和circ Tbcld20每种剂量减少到原来的1/3转染细胞,共同转染细胞,发现促进细胞增殖的作用较任何一个circ RNA单独转染要高。对这个三个circ RNA下游的mi RNA取交集进行分析,结合mi RNA测序数据,筛选到mi R-322-5p、mi R-497a-5p、mi R-6340和mi R-6918-5p四个共同的靶mi RNA以及一系列共同的靶基因,提示circ Dcbld2、circ Mapk1以及circ Tbcld20可能通过这些靶mi RNA以及靶基因共同发挥协同作用。【结论】circ RNA测序结果经验证可靠性较高。circ RNA较对应靶基因的m RNA在BPA处理下反应更灵敏更剧烈。p LCDH-ci R载体可成功地和较为方便地实现多种circ RNA的过表达,其中以序列较短的circ RNA可能可以实现较高的表达倍数。一些升高的circ RNA可以在BPA引起的GC-2细胞凋亡中起到保护作用。这种在毒性暴露下非编码RNA的保护性作用可能为细胞对环境的自我调整和适应机制。同时,这种作用可以协同实现,为circ RNA在生殖毒性方面的多靶点干扰提供了新角度和新思路。第三部分circMapk1的功能及下游作用机制研究【目的】探索circ Mapk1在BPA致精母细胞毒性中的作用和下游分子机制【方法】采用RNase R消化进一步确认circ Mapk1的环状特性。在c DNA和g DNA中采用“背对背”引物扩增circ Mapk1,以确认circ Mapk1的确存在。在不同发育阶段小鼠睾丸提取的RNA后逆转录的c DNA中扩增circ Mapk1和Mapk1的m RNA,确定circ Mapk1在睾丸发育过程中的表达情况。采用circ Mapk1过表达载体转染GC-2细胞,q PCR检测circ Mapk1的过表达情况,并同时检测circ Mapk1过表达对Mapk1 m RNA的影响。采用CCK-8检测过表达circ Mapk1后GC-2细胞24h、36h、48h细胞活力的情况,以及BPA暴露后同时转染circ Mapk1的情况。应用Edu掺入法检测转染circ Mapk1后细胞DNA复制的情况。用Annexin V-APC/7-AAD试剂盒在BD流式细胞仪上检测细胞的凋亡情况。采用生物信息学方法预测circ Mapk1下游的mi RNA以及靶基因。双荧光素酶验证circ Mapk1与mi RNA的结合,并在各发育阶段的小鼠睾丸中q PCR检测circ Mapk1和mi RNA的共表达情况。采用mi RTar Base预测mi R-214-3p的靶基因,采用q PCR验证mi R-214-3p过表达后靶基因的改变,筛选出有明显下调的靶基因和circ Mapk1过表达后上调的靶基因取交集,得到两者可能共同作用的靶基因。采用p VAX1载体构建这些靶基因的过表达载体对其进行功能研究后寻找出促进细胞增殖的靶基因。进一步采用荧光素酶报告实验验证其是mi R-214-3p的靶基因。采用Western Blot检测mi R-214-3p以及circ Mapk1过表达后靶基因蛋白的改变,证实通路存在。【结果】RNase R消化后,线性RNA如Actb和Mapk1的m RNA均显著降低,而circ Mapk1未被消化,反而因为线性的消化而显著富集升高,证实circ Mapk1确实为环状。在c DNA中能扩增出circ Mapk1而在g DNA未能扩增,证实circ Mapk1并非基因组上的非特异性片段。在出生后的小鼠睾丸中,circ Mapk1的表达呈下降趋势,而Mapk1的m RNA表达趋势相对稳定,提示circ Mapk1的表达并非Mapk1转录副产物,而是有其它调控机制。CCK-8实验,Edu实验,以及流式细胞学实验证实过表达circ Mapk1可以促进GC-2细胞的增殖,抑制BPA导致的细胞凋亡。生物信息学预测显示,circ Mapk1可以结合mi R-29a-5p,mi R-152-5p和mi R-214-3p等mi RNA。荧光素酶报告实验证实circ Mapk1和mi R-214-3p的结合。q PCR检测在出生后不同天数的小鼠睾丸中circ Mapk1和mi R-214-3p表达高度相关,进一步提示circ Mapk1可能和mi R-214-3p互相作用。对mi R-214-3p进行mi RTar Base的预测出靶基因,结合其功能筛选出12个与细胞增殖凋亡相关的基因,q PCR检测发现其中5个明显下调。和circ Mapk1过表达后上调的靶基因取交集后发现Akt1,Ctgf和Pkn3可能为其共同作用的靶基因。对这三个基因进行功能研究后发现Akt1过表达能显著促进GC-2细胞增殖。荧光素酶报告实验证实mi R-214-3p和Akt1之间的互作。Western Blot检测发现AKT1蛋白可以受mi R-214-3p下调,受circ Mapk1上调,提示circ Mapk1可能通过吸附mi R-214-3p上调AKT1促进细胞的增殖。【结论】circ Mapk1可保护BPA导致的生精细胞凋亡,并可以通过吸附mi R-214-3p,上调促增殖蛋白AKT1发挥作用。第四部分:BPA暴露对circ RNA表达的上游调控机制研究【目的】研究BPA暴露下circ RNA表达改变的上游调控机制。【方法】从转录调控因子和RNA结合蛋白两方面研究BPA暴露对circ RNA表达的上游调控机制。在转录调控因子方面,通过UCSC网站提取表达改变的circ RNA转录起始位点上游2000 bp序列,输入JASPAR转录因子预测网站,寻找circ RNA启动子区域可能结合的转录调控因子。q PCR检测这些转录调控因子BPA处理后是否升高。采用p VAX1载体过表达转录调控因子,检测circ RNA是否会在BPA处理的情况下升高。在RNA结合蛋白方面,先在UCSC网站上查询在本研究中BPA暴露下显著改变的circ RNA两端的侧翼序列是否存在反向互补的情况,为RNA结合蛋白的作用寻找依据。再通过文献查找与circ RNA生成相关的RNA结合蛋白,q PCR及Western Blot检测其在BPA暴露下的改变,并采用p VAX1载体进行过表达以及si RNA进行敲低检测对circ RNA表达的影响。【结果】经过JASPAR网站在线预测,共获得这些circ RNA共同可能受到调控的转录调控因子数十个,筛选出雌激素相关通路的雌激素受体ESR2作为可能的转录因子。q PCR检测ESR2的m RNA在BPA处理后显著上升。采用p VAX1过表达ESR2可达数百倍以上,但检测circ RNAs无明显改变,说明ESR2可能不是调控这些circ RNAs在BPA处理下升高的因子。在BPA暴露下显著改变的circ RNAs中,半数的circ RNAs在两侧的内含子区域均查询到了侧翼互补序列,包括上一部分详细研究的circ Mapk1,这为RNA结合蛋白调控这些circ RNA的生成提供了一定的依据。经文献查询筛选到ADAR1和QKI可“广谱”参与circ RNAs生成的调控。采用敲降ADAR1和QKI的si RNA转染细胞,q PCR检测敲低效果均可达到1/2以下。检测circ RNAs表达发现的ADAR1敲低对circ RNAs水平无明显作用,但敲低QKI后circ RNAs水平均明显升高。反之,构建QKI过表达载体转染细胞,发现circ RNAs水平均明显降低。提示QKI可以调控circ RNAs的表达。同时,Western Blot表明BPA暴露后QKI蛋白明显降低,且随着BPA浓度的升高QKI蛋白下降的越明显,这也与BPA暴露后多种circ RNA表达上升趋势相符。【结论】相对于转录调控因子,BPA处理下GC-2细胞中circ RNAs的改变可能更受RNA结合蛋白的调控,在BPA的刺激下,细胞通过下调QKI蛋白的表达,上调一些具有保护作用的circ RNA的表达,吸附一些促凋亡的mi RNA,上调保护性蛋白的表达,抵抗BPA造成的生殖毒性。