急性心肌梗死(AMI)是心血管疾病中较为严重的一种,心脏细胞长时间的缺血可能会引起心肌组织死亡,甚至导致心脏衰竭。由于缺乏快速的即时诊断技术,死亡率却居高不下,因此,精确的分析AMI相关的生物标志物对临床诊断和治疗意义重大。针对急性心肌梗死相关的miRNA(miRNA-499、miRNA-133a等),构建能够在实际环境中识别并且检测microRNA(miRNA)的核酸传感平台,是本论文的主要研究内容。此外,由于miRNA易于降解并且在人体血液中含量较低,如何建立可靠灵敏的检测方法也是本论文的研究重点。为了提高检测miRNA的灵敏度和准确性,我们将核酸放大技术与多种现代光谱技术结合,利用化学发光方法(CL),电致化学发光技术(ECL)以及表面增强拉曼光谱技术(SERS),进行病人血清中心梗疾病相关miRNA的检测。本论文包括以下几个部分:1)球形核酸酶促进的化学发光miRNA手机成像目前AMI已发展为严重威胁世界各国健康及死亡的疾病之一,且有可能突然发生在家中或室外。虽然目前已建立了多种检测方法,但缺乏先进的诊断设备,因此开发简便易行的即时诊断方法具有重要意义。为此,我们构建了以智能手机为便携式探测器的化学发光miRNA成像传感平台,首次实现了在病人血清中可视化检测急性心梗相关miRNA。首先,我们构建了一种球形核酸酶(称为SNAzyme),该酶由在金纳米颗粒核上形成的致密DNAzyme层衍生而来,与G4-DNAzyme本身相比,其在真实血液样本中催化活性提升了约100倍,并具有更好的抗核酸酶降解能力。这些独特的特性使得球形核酸酶促进的化学发光平台在分析与急性心梗相关的miRNA时具有优越的成像性能。该目标miRNA被用于催化发夹环DNA组装,以产生具有粘性末端的双链DNA,将SNAzyme纳米标签捕获到底物上。通过这种方法,我们成功地检测到了miRNA-133a,其可成像检测限为1 nM,并且对患者血液中其他miRNA类似物具有较高的选择性。鉴于其在生理环境中的独特特点,我们的SNAzyme促进的成像平台在AMI的即时诊断中具有广阔的发展前景。2)目标诱导的放大负载球形核酸酶纳米催化剂用于超灵敏电致化学发光双重放大检测miRNA目前已建立了多种检测心梗疾病相关miRNA的方法,但很多方法需要复杂的仪器设备,或者检测灵敏度有待提高,因此仍急需开发简便易行且灵敏度高的诊断方法。根据上一部分工作,我们构建了以球形核酸酶为探针的电致化学发光miRNA检测平台,并借助杂化链式扩增反应来实现信号放大。球形核酸酶因其独特的抗干扰能力及较强的催化活性在分析与急性心梗相关的miRNA时具有较好的实际应用性。首先,目标miRNA被用于打开修饰在电极上的探针发夹环DNA,以打开发夹环上的触发端从而引发杂化链式扩增反应,通过产物结构上的互补双链将球形核酸酶捕获到电极基底上。通过这种方法,我们成功地检测到了心梗疾病相关的两条miRNA。实验结果表明此方法检测的线性范围较宽,灵敏度高且仪器设备简单,因而该平台在AMI的临床诊断及治疗中具有更为理想的应用前景。3)组分可控的金/银空腔SERS纳米探针结合目标物催化的发夹环组装用于三重放大检测miRNA在这个工作中,我们合成了组分可控的金/银空腔球形SERS探针,并将这一探针应用到目标物催化的发夹环组装策略中建立了一个超灵敏的SERS生物传感器用来检测急性心梗疾病相关的miRNA(miRNA-133a)。通过电置换的方法可以精确控制金银组分的比例,这种双金属探针具有很强的等离子体共振效应及较高的稳定性。随后,通过目标物催化的发夹环组装产生的连接双链将空腔探针抓捕到等离子体共振芯片上,可以实现三重信号放大。该传感器对目标miRNA-133a线性检测范围较宽,其检测限可低至0.306 fM,并且对人心脏中同时表达的其他miRNA具有较高的选择性。在人体血液样本中的应用表明,我们开发的传感平台在生理环境下具有强健的抗干扰能力和理想的灵敏度,具有潜在的生物医学应用价值。4)核酸外切酶Ⅲ促进的级联反应用于超灵敏SERS检测疾病相关核酸标志物得益于目前所取得的一些核酸检测技术的启示,我们将酶切放大方法用来促进等温核酸放大,将这一两步放大技术与SERS技术结合从而建立了一个信号增强的核酸传感平台。由于外切酶Ⅲ高效的剪切效率及较强的识别能力,可以生成大量的促发链从而启动多个杂化链式扩增反应。探针分子标记的发夹环DNA被串联在一起,随后该产物结构被固定并富集在等离子体共振基底上实现超灵敏SERS检测。实验结果表明,该检测平台对心肌梗死相关核酸标志物有很高的灵敏度,检测限可低至lfM,能较好地鉴别出单个碱基错配的核酸。该策略为核酸标志物检测提供了一个有力的信号放大工具,甚至可以在血液样本中工作。