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水牛具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长等优点,非常适合我国南方农村饲养,是我国南方极具开发价值的大家畜。口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的以侵害偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触性传染病,被世界动物卫生组织列为A类动物传染病。为应用水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子进行基因沉默研究,探讨应用RNAi沉默水牛口蹄疫病毒的可行性,本研究对水牛的7SK和U6启动子进行了克隆与活性分析,并应用其构建了多启动子串联RNAi抗口蹄疫病毒转基因小鼠模型,取得了如下的研究结果：1、水牛7SK和U6启动子克隆与功能分析。参考牛的基因组序列,设计特异性扩增引物,成功克隆了长430bp和357bp的水牛7SK (Genbank序列号：JN417658)和U6启动子(Genbank序列号：JN417659)。为对比不同物种polⅢ启动子的活性,本研究还克隆了人、猪和牛的7SK和U6启动子。克隆的启动子与针对EGFP的短发卡RNA (shRNA)双链DNA片段(shEGFP)相连接,成功构建8个EGFP沉默表达载体(pbu7SK-shEGFP、 pbuU6-shEGFP、ph7SK-shEGFP、phU6-shEGFP、pbo7SK-shEGFP、 pboU6-shEGFP、pp7SK-shEGFP和ppU6-shEGFP)。将构建的载体转染水牛胎儿成纤维细胞(BFF),转染后72小时通过茎-环QRT-PCR检测细胞RNA中的shEGFP相对表达量。结果显示,以h7SK-shEGFP组为100%,bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP组中的shEGFP含量高达257.17%(±33.79%)和174.67%(+32.94%),表明水牛7SK和U6启动子能启动shEGFP在细胞中高效表达。将构建的载体与pEGFP-N1共转染水牛和小鼠细胞,转染后60h在荧光显微镜下可观察到共转shEGFP表达载体的细胞发生了明显的荧光表达沉默现象；转染后72h的BFF流式细胞仪分析发现,转入pbu7SK-shEGFP和pbuU6-shEGFP的细胞中沉默EGFP效果显著高于其它各组,沉默效率高达93.82%(±0.16%)和87.45%(±0.52%)(p<0.05)。QRT-PCR的检测结果显示,pEGFP-Nl与bu7SK-shEGFP共转染水牛细胞的EGFP表达水平(下降93.29%±1.30%)和buU6-shEGFP共转染的EGFP表达水平(下降93.45%±1.25%)差异不显著(p>0.05),两者的EGFP表达水平均显著低于其它物种启动子的共转染组(p<0.05)。在小鼠细胞中,共转染bu7SK-shEGFP的EGFP沉默效率最高(下降91.29±1.03%)。上述结果表明,克隆得到的水牛7SK、U6启动子可以高效启动shRNA的表达,进而产生沉默目的基因的RNA。2、多shRNA串联抗口蹄疫病毒RNAi载体的构建。首先针对口蹄疫病毒3B和3D保守区域设计并化学合成三个shRNA串联片段,然后分别连接水牛7SK、水牛U6和牛U6启动子,构建成bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3三个shRNA串联表达盒,并连接入慢病毒载体质粒pSicoR构建成抗口蹄疫转基因载体pSicoR-3shRNA(用CMV启动的EGFP作为标记基因)。利用慢病毒三质粒包装系统pNRF、pVSVg和pSicoR-3shRNA共转于293T细胞包装成慢病毒颗粒,然后感染BHK-21细胞,获得转基因细胞,通过茎环RT-PCR检测转基因细胞的针对口蹄疫病毒的三个shRNA表达。为验证转基因细胞和慢病毒载体的口蹄疫病毒抗性,首先将O型口蹄疫病毒接种入表达抗口蹄疫shRNA的BHK-21转基因细胞中,观察比较接毒后48h内转基因细胞中口蹄疫病毒复制情况,同时分别将滴度为1000、100、20和5LD5o的O型FMDV毒株接种于抗口蹄疫慢病毒载体预处理过的3-5日龄乳鼠(LV),以接毒PBS预处理乳鼠作为对照(NC)。细胞抗性结果显示,与普通细胞相比,转基因细胞在接种病毒后6h到48h内对口蹄疫病毒的复制有明显的抑制,其中在接种后24h抑制效果最佳,高达67.48%。小鼠抗性结果显示,接毒后72h内NC组在5LD5o滴度下有2只乳鼠发病死亡,在20LD50滴度下无乳鼠存活,而LV组在5LD5o滴度下全部乳鼠均存活,在20LD5o滴度下仍有三只乳鼠存活至第7天,且LV组在各滴度内死亡乳鼠的存活时间相比NC组均有所延长。上述结果表明,构建的多shRNA串联表达抗口蹄疫转基因载体能提高BHK-21细胞和乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力,有效地避免了5LD50滴度内乳鼠的死亡现象,具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能。3、多shRNA串联抗口蹄疫病毒RNAi转基因小鼠模型的制备：将抗口蹄疫多shRNA串联表达盒bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-CMV-EGFP片段纯化后显微注射到小鼠的受精卵中获得27只小鼠,经PCR检测,7只为转基因阳性小鼠。选择其中两只表达EGFP的亲代小鼠分别传代至F6-7代,经PCR和Southern blotting检测,每代每窝的阳性小鼠比例约为50%-60%,表明转基因小鼠中整合的目的片段具有良好的遗传稳定性。通过激光共聚焦显微镜对F0-7和FO-14两个亲本小鼠的F3后代各组织的冰冻切片进行观察,发现在F0-14小鼠后代心、脾、肾的组织可见较强的荧光表达,而在F0-7小鼠后代只有脾脏表达的荧光略强于前者,其余组织表达荧光均相对F0-14后代较弱。通过茎环RT-PCR对两个亲本组织中三个抗口蹄疫shRNA表达量进行测定,在F0-14中三个shRNA的表达水平均高于F0-7。选择FO-14的后代作为转基因阳性小鼠代表进行抗病毒能力检测试验,将转基因阳性及普通乳鼠分别颈后皮下注射1000LD50、100LD50、20LD50和5LDso的O型FMDV0.2mLc结果发现,接毒72h后1000LD50、100LD50、20LD50滴度下转基因及普通乳鼠均无存活,而在5LDso滴度组内转基因乳鼠死亡数量低于普通组。为进一步确认这一结果,分别用20LDso和5LDso滴度的O型FMDV注射10只乳鼠,发现注射5LD50滴度的普通乳鼠仅存活3只(30%),而转基因乳鼠存活8只(80%)。在乳鼠死亡后或接毒后72h分别对胴体、心脏、肝脏及肾脏中的FMDV病毒量进行Q-PCR检测,发现死亡的转基因乳鼠各组织的病毒量并没有低于普通组,而存活的转基因乳鼠各组织内FMDV病毒量略低于存活的普通小鼠。上述研究结果为进一步建立抗口蹄疫转基因水牛提供了有力的实验依据,同时也为通过RNAi技术改良水牛以至其它物种的繁殖和泌乳性状,培育转基因水牛新品种奠定了良好的基础。