论文部分内容阅读
[目的]探讨肝细胞癌中SPARC对糖酵解的调节作用及其分子机制,为SPARC作用于5-Fu耐药的肝癌细胞,使耐药肝癌细胞对5-Fu重新敏感的临床应用提供理论基础及实验依据。[方法]本研究选取Hep G2,Hep3B,Huh7三株肝癌细胞,转染SPARC或si RNA SPARC后,应用比色法分别检测转染后的三株肝癌细胞中葡萄糖摄取量以及乳酸生成量以及糖酵解转运蛋白Glut1和关键酶HKⅡ、LDHA的活性变化;应用低浓度逐渐递增的5-FU诱导生成耐药Hep G2细胞;Western blotting法检测缺糖条件下SPARC、AMPK、Thr-172 AMPK的表达情况,及5-FU耐药Hep G2细胞和敏感细胞中糖酵解代谢关键酶的变化情况;RT-PCR法检测糖酵解关键基因Glut1、HKⅡ、LDHA的m RNA水平;在耐药细胞中敲除Glut1、HKⅡ、LDHA的表达,或转染SPARC,或瞬时共转染SPARC与糖酵解关键基因Glut1、HKⅡ、LDHA,分别应用台盼蓝拒染法比较处理前后细胞对5-FU敏感性的变化,并应用该方法检测缺糖环境下SPARC对于Hep G2细胞活力的影响。[结果]过表达SPARC的肝癌细胞中葡萄糖摄取及乳酸生成量明显下降,糖酵解转运蛋白Glut1及关键酶HKⅡ、LDHA的活性下调,反之,转染si RNA SPARC的肝癌细胞中糖酵解作用上调;过表达SPARC的Hep G2细胞在缺糖条件下细胞活力下调幅度较对照组减少,同时AMPK、Thr-172 AMPK的表达上调;5-FU耐药肝癌细胞中糖酵解关键基因Glut1、HKⅡ、LDHA的m RNA水平及蛋白水平上调;5-FU作用于过表达SPARC的Hep G2细胞时,细胞活力较对照组明显下降;耐药Hep G2细胞中SPARC过表达时,细胞对5-FU的敏感性提高,当瞬时共转染SPARC与糖酵解关键基因时,细胞对5-FU不再重新获敏。[结论]肝细胞癌中,SPARC通过下调糖酵解的葡萄糖转运蛋白Glut1及关键酶HKⅡ、LDHA负性调控糖酵解作用;SPARC能够促使肝癌细胞耐受缺糖环境;5-FU耐药的肝癌细胞中糖酵解过程下调,关键酶的表达及活性下调。过表达的SPARC能够提高Hep G2细胞对5-FU的敏感性,并可以通过下调糖酵解过程使耐药肝癌细胞对5-FU重新敏感。