新城疫病毒NDV作为不分节段负链RNA动物病毒，具备很多作为疫苗载体的优势。在体内，NDV载体可稳定表达外源基因，其与同源的RNA病毒不发生重组；安全稳定，成本低廉；弱毒株对人和动物无致病性；免疫接种途径简单；能够诱导机体产生良好的体液免疫、黏膜免疫及局部免疫。因而，新城疫病毒作为疫苗载体引起越来越多学者的关注，有很大的应用前景。随着反向遗传操作技术的发展，通过构建感染性cDNA克隆拯救负链RNA病毒，不只在研究病毒蛋白功能和基因作用元件提供了更好的方法，也实现了负链RNA病毒作为载体表达外源基因。在NDV反向遗传操作系统中，新城疫病毒的核衣壳蛋白NP必须与操纵RNA合成的辅助蛋白相互作用，才能完成RNA的合成。在L蛋白和P蛋白辅助下，NP与病毒的基因组RNA包装成感染性的核糖核蛋白复合体(RNP)，从而进行NDV的转录和翻译，启动NDV的复制。 本研究选用新城疫病毒弱毒株LaSota疫苗株，将其感染敏感细胞Vero细胞，待细胞出现明显病变后，用Trizol法提取细胞的总RNA。用分别引入XhoI、EcoR I两个酶切位点的两对引物通过两步法分别对NP、P基因进行RT-PCR扩增，得到了大小与实际相符的两个基因片段。将所得的结果加A反应后，与pGEM-T easy载体连接、转化、克隆，测序。得到含有两个基因片段的重组质粒。用Xhol I、EcoR I分别将NP、P片段在T载体上酶切下来，与真核表达载体pcDNA3．1(+)连接，转化，克隆后提取质粒，命名为pcDNA3．1(+)-NP、ocDNA3．1(+)-P。通过PCR、酶切及测序验证克隆正确。将重组质粒分别转染到293、BHK-21细胞中，72小时后，用RT-PCR法检测两个基因在细胞中的转录情况，结果表明两个基因分别在两个细胞中所得的四个样本NP-293、NP-BHK-21、P-293、P-BHK-21得到了有效的转录。用免疫酶法初步地检测两个基因在细胞中的表达情况，DAB染色后可见，与正常的293及BHK-21细胞比较，转染后的细胞部分为阳性的褐色细胞，可初步认定转染成功。用WesternBlot方法可精确地鉴定两种蛋白在两种细胞中的表达情况，经SDS-PAGE胶电泳后转膜，进行Western Blot检测，其中P蛋白的大小约为42．3KD，NP蛋白的大小约为53KD，经DAB染色后可见清晰褐色条带，其大小与预期结果基本相符，说明pcDNA3．1(+)-NP、pcDNA3．1(+)-P表达载体构建成功。本研究成功地表达了新城疫病毒LaSota株完整的NP、P基因片段，并利用RT-PCR、免疫酶法、Western Blot三种方法准确无误地检测了两个蛋白在两种细胞中的表达情况。为即将进行的反向遗传操作拯救NDV复活奠定了基础。