家蚕是鳞翅目昆虫的模式生物,也是重要的遗传研究模型。家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,Bm CPV)是家蚕主要病毒病原之一,可以引起家蚕群体内中肠型脓病的发生。迄今为止,国内外有关家蚕对BmCPV的防御机制的研究报道较少,养蚕生产上对中肠型脓病的防治也仅是以预防为主。不同家蚕品种对BmCPV感染的抵抗性有一定的差异,但尚未培育出抗BmCPV的家蚕品种。为了从分子水平上探索家蚕抵抗BmCPV感染的防御机制和不同家蚕品种对BmCPV的免疫调控机理,我们前期通过高通量测序技术分析筛选了家蚕品种4008(BmCPV易感)和P50(BmCPV抗性)在感染BmCPV后的差异表达基因,发现家蚕中肠的类胰岛素相关肽结合蛋白2(Bombyx mori insulin-related peptide-binding protein,BmIBP2)基因的表达水平明显上调,且在抗性品种中的上调表达倍数高于易感品种,生物信息学分析推测IBP基因与细胞凋亡及免疫防御有关,因此推测BmIBP2参与了家蚕抵抗BmCPV感染的防御机制。本研究成功表达了BmIBP2的重组蛋白rBmIBP2,研究该蛋白对家蚕细胞增殖的影响,并采用RNA干涉及过表达技术研究了BmIBP2基因的功能,进一步鉴定获得一个BmIBP2的互作蛋白。得到的主要实验结果如下:1.BmIBP2基因在Bm CPV和其它几种病原侵染家蚕中肠中的差异表达通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了家蚕感染质型多角体病毒(BmCPV)、核型多角体病毒(BmNPV)、二分浓核病毒(BmBDV)、球孢白僵菌(Beauveria bassina)、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)后不同时间点中肠组织中BmIBP2的表达情况,结果发现BmIBP2基因不仅在BmCPV感染的家蚕中肠上调表达,在其他病原感染的家蚕中肠,也发生一定的差异表达,说明该基因参与了家蚕对病原感染的应答与防御过程,并且具有重要的免疫防御功能。2.BmIBP2蛋白对家蚕培养细胞增殖的影响首先通过原核表达系统对BmIBP2基因进行重组表达,对表达的重组蛋白进行纯化复性后添加入家蚕BmN细胞培养基中,通过MTT法检测该纯化蛋白对BmN细胞增殖的影响,并检测了蜕皮激素20E对BmIBP2基因的调控作用。结果表明,纯化的重组蛋白rBm IBP2对家蚕BmN细胞的增殖具有一定的抑制作用,并且20E能够促进家蚕细胞中BmIBP2的表达。进一步通过RNAi和基因过表达技术探索了BmIBP2基因的功能。采用化学合成法合成了BmIBP2基因的si RNA及negative control siRNA,转染家蚕BmN细胞,检测其对细胞增殖的影响,同时检测BmIBP2基因及糖代谢相关呼吸酶基因的表达变化情况。RNAi实验结果显示,BmIBP2基因被干扰沉默后,与对照组相比,BmIBP2基因呈现下调表达,家蚕BmN细胞增殖速度加快,同时检测到糖代谢相关呼吸酶基因呈现上调表达。同时,我们构建了转基因表达载体pIZT-IBP2对BmIBP2基因进行过表达,实验结果显示,与对照组相比家蚕BmN细胞增殖速度减慢,并且糖代谢呼吸酶相关基因呈现下调表达。3.BmIBP2互作蛋白的筛选与鉴定利用Bac-to-Bac表达系统将BmIBP2和EGFP在家蚕细胞中进行融合表达,其中EGFP基因作为报告基因,经同源重组获得vBmEGFP-IBP2重组杆状病毒穿梭质粒。转染家蚕细胞并用SDS-PAGE和Western-blot方法检测重组蛋白的表达,结果发现重组蛋白成功表达,大小约为55kDa。随后收集蛋白并利用EGFP作为抗原决定簇通过免疫共沉淀技术筛选与BmIBP2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白。通过免疫共沉淀实验,我们筛选到一个与BmIBP2有相互作用的蛋白,经质谱鉴定为家蚕ATP合成酶(Bombyx mori ATP synthase)。经酵母双杂交实验验证,家蚕类胰岛素相关肽结合蛋白2与家蚕ATP合成酶之间的确存在相互作用。上述研究结果不仅可为深入了解BmIBP2基因参与家蚕抵抗BmCPV感染的途径及其作用机理提供了有力依据,而且为进一步揭示BmIBP2的生物学功能及家蚕抗BmCPV的分子机制奠定了良好的基础和依据。