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近年研究指出恶性肿瘤的发病率在呈逐年上升的趋向,严重损害到人类的身体健康。因此研发新型抗肿瘤活性物质对恶性肿瘤的预防治疗迫在眉睫。然而恶性肿瘤、高血压、肾脏疾病、动脉硬化、心梗、神经变性疾病等多种疾病的发生与发展与自由基的过剩都密切相关,因此开发抗氧化制剂对于疾病的防治亦具有广阔的应用前景。本研究以石斛酚作为石斛中的主要活性成分,具有广泛的生理活性,但其对肝癌的作用尚不完全明确。因此进行了体外抗肿瘤及抗氧化活性研究,本研究结果将为石斛药材的开发利用提供科学理论依据。目的:基于人肝癌细胞HepG2与骨髓间充质干细胞,分别对石斛酚的抗肿瘤与抗氧化的进行生物活性研究,并进一步深入其发挥作用的机制。方法:1.以人肝癌细胞HepG2为研究对象,采用MTT法测定石斛酚的细胞毒作用;采用Hoechst33258,并通过荧光显微镜观察染色处理的HepG2的细胞凋亡形态图;采用Annexin V-PI双染,通过细胞流式仪检测HepG2的细胞凋亡率;以及采用蛋白印迹法(Western blot)检测相关凋亡蛋白 p-Akt/Akt、PARP、p53、Caspase-3的表达能力,从而探索石斛酚的抗肿瘤作用的途径及机制。2.以大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)为研究对象,用不同浓度(0-100 μM)的石斛酚处理rBMSC后,再用600 μ过氧化氢(H2O2)处理rBMSC细胞2h,采用CCK-8法测定石斛酚对H2O2致rBMSC损伤的细胞保护作用;采用荧光显微镜及细胞流式仪从细胞形态及凋亡率方面分析检测石斛酚的细胞保护作用;以及采用蛋白印迹法(Western blot)检测相关凋亡蛋白p-Akt/Akt、Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达能力,从而探索石斛酚的抗氧化作用的途径及机制。结果:1.石斛酚对人肝癌细胞HepG2的生长具有一定的抑制作用。用不同的浓度的石斛酚(1-150μM)分别处理HepG2细胞12、24和48小时后,MTT结果指出石斛酚明显抑制HepG2细胞增殖(P<0.01)。用Hoechst 33258染色细胞后荧光拍摄形态凋亡图表明,当用石斛酚处理HepG2细胞48 h后出现典型的诱导凋亡形态学特征,如:细胞变小,细胞核固缩,胞膜皱缩,致密浓染并伴有核型的不规则变化,出现核碎裂等凋亡的典型特征。进一步使用流式细胞仪检测结果指出当用150 μM石斛酚处理细胞时,凋亡率达到20%。此外,Western blot实验表明石斛酚增强caspase-3,PARP和p53的蛋白表达能力,并下调p-Akt/Akt的表达。且LY294003组(PI3K/Akt通路抑制剂)结果完全与只给石斛酚给药组一致(P<0.01)。2.不同的浓度的石斛酚(1-100μM)对rBMSC无任何细胞毒作用(P>0.05),且对600 μM的H202致rBMSC损伤有明显的细胞保护作用(P<0.05)。用Hoechst33258染色细胞后荧光拍摄形态图可以看出,H2O2组处理的细胞有典型的诱导凋亡形态学特征,如:细胞数量减少,细胞核固缩,胞膜皱缩,在培养液中漂浮有凋亡碎片,出现核碎裂等凋亡的典型特征。而石斛酚给药组有明显改善凋亡形态的现象。进一步使用流式细胞仪检测结果指出当用80 μ石斛酚处理细胞时,与H202组相比,凋亡率从49.5±3.30%下降到23.4±2.06%,且通过荧光显微镜观察发现石斛酚能明显降低ROS的水平。此外,与H2O2组相比,Western blot实验表明石斛酚增强p-Akt/Akt的表达,并下调Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达能力。且LY294003组(PI3K/Akt通路抑制剂)结果完全与石斛酚给药组相反。结论:研究数据表明了石斛酚确实具有抑制人肝癌细胞HepG2的生长并诱导其凋亡的作用,并且通过调节PI3K-Akt信号通路诱导HepG2生长抑制及细胞的凋亡。石斛酚是通过PI3K-Akt信号通路发挥对H2O2致rBMSC损伤有明显的细胞保护作用。这些数据表明石斛酚可以发展成为一种有希望的神经保护剂,用于在缺血性疾病中成功的MSC移植。