HCV是1989年才确定的主要经血传播、可引起急慢性肝炎的病原。绝大多数成年感染者(80%以上)为慢性、持续性感染,且20%以上在20年内将最终发展为肝硬化、肝癌。根据中国疾控中心公布的法定传染病监测报告,2010年中国HCV发病人数超过15万,比2009年增加了15.49%。HCV感染与传播已经成为全球性公共卫生问题,理论上HCV疫苗是预防丙肝最经济有效的医学手段。HCV是单股正链RNA病毒,编码一个长约3011aa的多聚蛋白,经宿主蛋白酶与病毒蛋白酶裂解成10种蛋白,包括结构蛋白(C/E1/E2/p7)与非结构蛋白(NS2/NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B)。HCV基因组存在很大的异源性,至少存在7种主要基因型和大约70种基因亚型,中国主要流行亚型为1b、2a,也有其它亚型感染报道；另外准种的存在也是产生宿主免疫逃逸及容易导致慢性感染的机制之一,严重影响了HCV疫苗研制的进程以及HCV预防与治疗的成功率。目前,HCV在体外不能大量有效繁殖及缺乏合适的经济的小动物模型,HCV自然感染过程中病毒清除的机制了解尚不够深入。研究认为除广谱中和抗体外,广谱的细胞免疫对提高HCV疫苗保护效率也是至关重要的。从具有广谱交叉活性的抗原入手,采用多种抗原联合免疫及不同疫苗“初免-加强”联合免疫成为HCV疫苗研发的重要策略。HCV感染与HIV感染特点存在许多相似性(持续性感染,高度变异的基因组,免疫逃逸机制不清,不能产生有效交叉中和抗体等),HCV疫苗的研发道路也困难重重,经历了许多挑战。迄今已经探索的策略包括：多肽疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗、重组病毒载体疫苗(主要是重组腺病毒和重组痘苗病毒)、VLP及各种疫苗的联合应用,部分疫苗已进入临床试验,但无一疫苗(尤其是预防性疫苗)呈现出较理想的保护效果并投入大规模人群应用。因黑猩猩是唯一的感染动物模型,近年来多个在黑猩猩中的实验结果表明：以非结构蛋白为靶抗原的重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫或以结构蛋白(C/E1/E2)形成的VLP疫苗结合佐剂应用在黑猩猩模型中皆取得了一定的保护效果,这些结果为HCV疫苗的研制带来希望,对十余个在黑猩猩上完成的HCV实验疫苗保护性结果进行综合分析(Meta-Analysis)表明：HCV结构蛋白可以激活T细胞应答介导病毒清除。基于HCV疫苗研究的需求与现状以及DNA疫苗、病毒载体疫苗、整合缺陷型慢病毒颗粒疫苗及联合免疫研究的最新进展,本论文选择HCV的结构蛋白core、E1、E2以及非结构蛋白NS3作为靶抗原(来源于HCV三种代表型别1a、1b、2a),采用多种疫苗形式：DNA疫苗、病毒载体疫苗,慢病毒颗粒疫苗进行免疫,系统分析了不同疫苗的免疫应答特点,并用替代性异质性攻击模型[表达2a亚型全长ORF的重组复制型痘苗病毒rTTV-JFH 1(3011)]评估其免疫保护效果,以期获得免疫反应强并具有广谱保护效果的HCV疫苗的抗原组分和免疫方案。为了达到上述研究目的,本论文进行了以下研究工作：1、DNA疫苗、病毒载体疫苗、整合缺陷型慢病毒颗粒疫苗的制备鉴定；2、各种疫苗在小鼠中的免疫应答特点及保护效果分析。研究取得的主要结果简述如下：一、DNA疫苗、病毒载体疫苗、整合缺陷型的慢病毒颗粒疫苗的制备鉴定。1、构建各种DNA疫苗,选用常规DNA疫苗载体(pVRC)及复制型DNA疫苗载体(pSC或pSCK),在前期工作基础上,以靶向DC分子的NS3 (DEC-NS3融合蛋白)或E2 (DEC-E2融合蛋白)为靶抗原,分别构建了pVRC-DEC-NS3, pVRC-DEC-E2及pSC-DEC-NS3;同时,经密码子优化与E2区高变区HVR1缺失,合成构建了两个靶抗原,即CE1E2Y与H155(CE1E2与NS3融合),分别插入到复制型DNA疫苗载体pSCK,构建了两个新型DNA疫苗即pSCK-CE1E2Y与pSCK-H155,酶切测序正确后用Western blot方法鉴定DNA疫苗靶抗原的表达,鉴定正确后进行大量提取,定量备用。2、构建制备了表达结构基因(C/E1/E2)及NS3与core部分基因融合(C44P)的重组腺病毒(rAd5-CE1E2与rAd5-C44P),表达NS3或CE1E2NS3 (H155)的复制型重组痘苗(天坛株)病毒(rTTV-NS3与rTTV-H155)和非复制型重组痘苗(天坛株)病毒(rTTVA CK-NS3与rTTV△CK-H155),以及表达2a亚型全长ORF的复制型重组痘苗(天坛株)病毒rTTV-JFH 1 (3011),利用Western blot或间接免疫荧光方法鉴定重组病毒载体疫苗能够正确表达目的蛋白。3、改造三质粒慢病毒包装系统,包括：构建了整合缺陷型慢病毒颗粒包装质粒,并体外分析确证其整合缺陷特性；将转导质粒中的报告基因(GFP)置换成HCV的非结构基因NS3；结合不同亚型(1a, 1b,2a) HCV包膜表达质粒,包装成携带NS3基因的HCV整合缺陷型慢病毒颗粒疫苗。改造后的HCV慢病毒颗粒经Western blot鉴定与设计相符,并在电镜下观察到颗粒结构。根据核心抗原p24定量试剂盒进行HCV整合缺陷型慢病毒颗粒的定量滴定,进行大量制备纯化,定量备用。二、各种疫苗在小鼠中的免疫应答特点及保护效果分析。1、为了分析HCV DNA疫苗的免疫学应答特点,我们选择了基于NS3和基于CE1E2两类质粒进行分析。1)基于NS3的DNA疫苗,比较常规非复制型DNA疫苗pVRC-DEC-NS3和复制型DNA疫苗pSC-DEC-NS3的免疫应答特点,结果表明：非复制型pVRC-DEC-NS3产生的NS3抗体水平(3000以上)和IFN-g分泌水平(200SFC以上)都高于复制型DNA疫苗pSC-DEC-NS3.2)基于CE1E2的DNA疫苗,复制型DNA疫苗pSCK-CE1E2Y和pSCK-H155两针免疫后经ELISA和ELISPOT能检测到特异性的体液免疫反应(ELISA)和细胞免疫反应(ELISPOT),三针免疫与两针免疫相比增加了针对E1、E2、core和NS3的抗体水平,总的针对E1、E2的抗体水平不高,未检测到交叉中和抗体；细胞免疫应答水平没有增加。替代性异质性攻毒结果表明单独DNA免疫的交叉保护效果欠佳。2、为了分析HCV重组腺病毒载体疫苗不同免疫途径与免疫方案的免疫学应答特点,分别用rAd5-C44P和rAd5-CE1E2免疫小鼠。结果表明,肌肉或皮下注射重组腺病毒免疫能产生有效持久的细胞免疫应答(ELISPOT),主要引起的是CD8+CTL反应(ICS)。rAd5-CE1E2单独滴鼻免疫或滴鼻初免肌肉加强引起的细胞免疫均低于相应其他各组,但滴鼻初免肌肉加强组可诱导较高的针对core的特异性抗体,明显高于其他各组。异型痘苗病毒的攻击显示：不同途径免疫方案的HCV重组腺病毒载体疫苗都具有保护效果。表达不同靶基因的腺病毒载体疫苗的应答特点有所差异。rAd5-C44P两针免疫没有提高单针免疫的应答水平,细胞免疫应答水平有所降低,而rAd5-CE1E2加强则可以增加针对core、E1、E2的细胞免疫反应,并可维持较长时间。3、为了分析HCV整合缺陷型慢病毒颗粒的免疫学应答特点,分别包装了三种型别(1a、1b、2a)的HCV整合缺陷型慢病毒颗粒(HCV’pp)疫苗,用序贯免疫、混合免疫和同型免疫三种免疫方式免疫,结果显示：单独的HCV’pp免疫可以引起明显体液免疫应答,包括产生针对E1、E2.NS3的抗体以及针对5a亚型假病毒的交叉中和抗体。免疫次数增加,体液免疫应答水平也提高。在免疫策略上,单独HCV’pp免疫时,不同型别序贯免疫或混合免疫产生的针对NS3的结合抗体以及针对5a亚型交叉中和抗体水平要高于同型免疫。佐剂(Al(OH)3+CpG)的添加对HCV’pp免疫效果没有影响。同时我们也比较了HCV’pp参与的联合免疫应答特点。DNA (pVRC-DEC-E2)初免2次后采用HCV’pp加强,明显增加了DNA单独免疫后的体液免疫应答。rAd5-CE1E2初免HCV’pp加强联合免疫,同时产生了较高的针对多个靶抗原(C、E1、E2、NS3)的细胞免疫反应和体液免疫反应,并随着HCV’pp免疫次数增加而增加。我们也比较了rAd5-CE1E2初免HCV’pp加强及HCV’pp初免rAd5-CE1E2加强两种联合免疫方案,结果表明两者均能产生针对靶抗原的特异性细胞免疫与体液免疫应答,其中HCV’pp初免rAd5-CE1E2加强产生的免疫应答水平(针对E2的抗体水平与针对E1的ELISPOT读数)高于rAd5-CE1E2初免HCV’pp加强组。4、为了分析DNA疫苗和重组病毒载体疫苗联合免疫的免疫应答特点,我们选取几种疫苗配伍方案,主要包括：1)表达各种靶抗原(NS3/CE1E2)的DNA疫苗初免、重组腺病毒加强的联合方案；与2)DNA疫苗初免、重组天坛株痘苗病毒(复制型或非复制型)加强的联合方案。利用ELISA检测抗原特异的结合抗体,ELISPOT检测抗原特异IFN-g分泌,ICS分析CD4+或CD8+T细胞中各细胞因子(IL-2,IFN-g,IL-4,TNF-α)的产生,采用异质性替代攻击模型(rTTV-JFH1(3011)腹腔接种)或抗原特异的体内杀伤实验(in vivo CTL)来评价免疫保护效果,对联合免疫方案的免疫学应答及免疫保护进行了系统分析。结果表明：DNA与重组腺病毒的联合免疫能产生较高的体液免疫和细胞免疫反应,可以交叉保护异型痘苗病毒攻击。其中以复制型质粒(pSC-DEC-NS3)DNA疫苗初免组产生的交叉保护效果优于常规DNA疫苗(pVRC-DEC-NS3)初免组,尽管前者产生的针对靶抗原的结合抗体(anti-C44P)明显低于后者,但两者产生的胞内细胞因子分泌特点存在差异；DNA疫苗(pSCK-CE1E2Y)初免两针重组腺病毒rAd5-CE1E2加强一次产生的抗体应答与细胞免疫应答(ELISPOT与ICS分析结果)均不同于DNA疫苗三针免疫组。前者针对core与E1抗原特异的IFN-g分泌(ELISPOT),分泌的TNF-α的CD4+T细胞比例、分泌的IFN-g的CD8+T细胞比例以及E2抗原特异的IFN-g与IL-2的CD4+T细胞比例、分泌IFN-g与TNF-α的CD8+T细胞比例(ICS)均高于三针DNA疫苗免疫组。DNA与重组痘苗病毒联合免疫也都能产生较高的体液免疫和细胞免疫反应,并且体内杀伤实验显示有较高的杀伤率。其中pSC-DEC-NS3初免,HCV重组痘苗病毒天坛株(rTTV)加强后所产生的针对靶抗原的体液免疫(ELISA,IgG)与针对NS3特异的细胞免疫应答(ELISPOT, IFN-g)均高于非复制型重组痘苗病毒(rTTVACK)组,ICS结果显示针对NS3-1和NS3-2肽池刺激,CD4+和CD8+T细胞均产生多种细胞因子(IFN-g、TNF-α、IL-2、IL-4),总体水平rTTV加强组较高,体内杀伤实验显示针对NS3特异的杀伤率,rTTV加强组为16%高于rTTV△CK加强组(10%)。在pSCK-H155质粒初免下,重组痘苗病毒加强提高了细胞免疫,对E1、E2抗体应答没有明显提高,也没有检测到交叉中和抗体,但对core和NS3的总抗体提高了4倍(rTTV△CK)至32倍(rTTV);非复制痘苗病毒加强显示出较强的细胞免疫应答水平,针对E1-21肽和E2-2肽池刺激,rTTV△CK加强组产生IFN-g的CD8+T细胞比例明显高于rTTV加强组；针对NS3-1和NS3-2肽池刺激,ELISPOT结果显示rTTV加强组产生的IFN-g水平明显高于rTTVACK加强组,ICS结果显示虽然rTTV加强组产生的IFN-g+的T细胞比例高于rTTV△CK加强组,但rTTV△CK加强组产生的TNF-a+和IL-2+的T细胞比例明显高于rTTV加强组。体内杀伤实验显示产生针对E1抗原特异的杀伤率,rTTV加强组为99.7%,rTTV△CK加强组为99.76%综上所述,本论文以HCV结构基因core、E1、E2或非结构基因NS3为靶抗原构建了多种新型HCV疫苗,在小鼠模型中系统分析了多种疫苗形式的免疫学应答特点,并初步建立了一套较完整的HCV免疫学评价方法,这些疫苗在小鼠中单独或联合应用均可诱发特异性的体液免疫和/或细胞免疫应答,不同免疫途径与疫苗配伍所诱导的免疫应答与免疫保护特点不同。在联合免疫方案中,重组病毒载体疫苗(腺病毒初免或加强,痘病毒加强)可诱导较强的细胞免疫应答与交叉免疫保护,而整合缺陷型慢病毒颗粒疫苗单独或联合(DNA,重组腺病毒)应用,可诱导较强的体液免疫应答(包括交叉中和抗体)。本论文首次报道的许多创新性结果为发展新型HCV疫苗及不同载体疫苗的联合与优化应用提供了科学依据和实验基础。