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背景：急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)治疗过程中,常伴随心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury, MIRI):在心肌缺血基础上,恢复血流后组织损伤反而加重的现象。MIRI机制复杂,主要包括氧化应激、炎性介质的积累释放以及细胞内钙循环紊乱。目前MIRI的主要防治措施有缺血预适应、缺血后适应及应用保护性药物等。在临床实践中,提前给予细胞保护药物,是减轻MIRI导致的心肌细胞凋亡的重要措施。具有抗氧化作用的药物,对MIRI有不同程度的缓解作用。金丝桃苷是一种存在于多种药用植物中的黄酮醇苷类天然化合物。相关研究发现,金丝桃苷具有抗炎、抗氧化及抑制钙超载等多种药理作用。为明确金丝桃苷在MIRI中的保护作用及机制,本研究通过在细胞、离体器官、在体动物三个层次建立心脏缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)模型,观察金丝桃苷减少MIRI过程中的氧化应激、减少细胞凋亡的作用并探讨其可能机制；观察其对心肌细胞钙循环及心脏再灌注心律失常的影响。第一部分：金丝桃苷对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究目的：探讨金丝桃苷对大鼠心肌细胞缺氧再复氧损伤的保护作用及机制。方法：选取新生乳鼠分离培养原代心肌细胞。培养的原代心肌细胞随机分4组：正常对照组(Control组)；单纯H/R组；H/R+HYP10组(H/R前12小时开始,培养液含HYP10μmol/L); H/R+HYP50组(H/R前12小时开始,培养液含HYP50μmol/L)。通过更换乏氧培养液与改变培养条件,造成4h/4h的缺氧/再复氧模型。复氧结束观察各组心肌细胞形态学改变；流式细胞仪检测细胞凋亡指数,CCK-8法检测心肌细胞存活率；检测心肌细胞SOD含量；检测细胞培养液中LDH、MDA含量；Western Blotting检测JNK、p38、Caspase-3蛋白含量。结果：(1)大鼠原代心肌细胞分离培养和H/R模型建立成功；(2)H/R后心肌细胞存活率较对照组明显降低(P< 0.05), H/R+HYP50组细胞存活率较H/R组升高(P<0.05)；(3)与对照组相比,H/R后心肌细胞SOD含量明显降低(P<0.05), H/R+HYP50组心肌细胞SOD含量较单纯H/R组和H/R+HYP10组升高(P<0.05)；(4)与对照组相比,H/R后心肌细胞培养液中LDH、MDA增多(P<0.05),H/R+HYP50组细胞培养液中LDH、MDA含量较单纯H/R组和H/R+HYP1o组降低(P<0.05)；(5)与对照组相比,H/R后心肌细胞JNK蛋白磷酸化水平增加,H/R+HYP50组心肌细胞p38、JNK平较单纯H/R组和H/R+HYP10组低(P<0.05)；(6)与对照组相比,H/R后心肌细胞Caspase-3蛋白含量增加,H/R+HYP50组心肌细胞Caspase-3蛋白含量较单纯H/R组和H/R+HYP10组降低(P<0.05)。结论：金丝桃苷降低H/R对心肌细胞的氧化应激损伤,降低细胞凋亡,其作用机制可能与抑制p38、JNK信号通路的活化相关。第二部分：金丝桃苷对离体心脏缺血再灌注损伤的影响及机制研究目的：研究观察金丝桃苷对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤对氧化产物、心肌细胞凋亡及JNK/Bax信号通路的影响。方法：术前给予200mg/kg/d金丝桃苷或DSMO灌胃7日,之后通过在Langendorff离体心脏灌流中,控制停止/恢复灌流时间30min/2h,制备全心I/R模型,Control组实验过程中正常灌流。I/R组灌流前以DSMO灌胃,I/R+HYP组灌流前HYP灌胃。再灌注结束后,留取心脏标本。(1)测定心室组织SOD, MDA含量；(2)Tunnel染色法检测左室游离壁心肌细胞凋亡比例；(3)Western Blot检测左室心尖处心肌组织JNK、p38蛋白磷酸化情况；(4)Western Blot检测左室心肌组织Bcl-2/Bax、TNF-α、NF-κB蛋白含量。结果：(1)与对照组相比,I/R后心肌组织SOD含量减少,MDA增多(P<0.05),HYP组较I/R组MDA减少(P<0.05); (2) Tunnel染色发现,I/R后左室游离壁心肌心肌细胞凋亡指数增高(P< 0.05), I/R+HYP组减少心肌细胞凋亡(P<0.05)；(3)与对照组相比,I/R组心肌组织JNK＝p38蛋白磷酸化水平升高(P<0.05), I/R+HYP组JNK＝p38蛋白磷酸化低于I/R组(P<0.05)；(4)与对照组相比,I/R组心肌组织Bax/Bcl-2升高；与I/R组相比I/R+HYP组减少Bax/Bcl-2升高(P<0.05)；(5)与对照组相比,I/R组心尖部心肌组织TNF-α、 NF-κB蛋白含量增加(P<0.05), HYP组TNF-α、NF-κB蛋白含量低于I/R组(P<0.05)。结论：金丝桃苷降低大鼠心脏离体灌流中I/R损伤造成的氧化产物增多,降低心肌细胞凋亡,降低部心肌组织TNF-α、NF-κB的增加,这可能与其减轻氧化应激、抑制p38信号通路的激活有关。第三部分：金丝桃苷减轻离体心脏缺血再灌注导致的心室电生理特性的改变目的：观察金丝桃苷对大鼠离体心脏再灌注后心室电生理指标及室性心律失常诱发率的影响。方法：分组及灌流处理同第二部分。再灌注结束后行电生理检查,测定记录左室前壁基底部、前壁心尖部、后壁基底部、后壁心尖部、游离壁五处MAP及心脏整体心电活动,评价心室电生理相关参数(1) APD、ERP、ERP/APD、空间离散度；(2)拟合动作电位恢复曲线APDR,并计算Smax;(3)起搏刺激测定左室游离壁APD电交替阈值,计算每搏变异度；(4)给予猝发型串刺激诱发室性心律失常,计算室性心律失常诱发率。结果：(1)与对照组相比,I/R组左室各部位APD、ERP延长,空间离散度增加(P<0.05),金丝桃苷减少I/R后APD、ERP延长,空间离散度增加(P<0.05)；(2)与对照组相比,I/R组左室各部位Smax明显增大(P<0.05)金丝桃苷减少I/R后Smax的增大(P<0.05)；(3)与对照组相比,I/R组左室ALT阈值和每搏变异度升高(P<0.05),金丝桃苷减少I/R后ALT阈值和每搏变异度的升高(P<0.05)；(4)与对照组相比,I/R组室性心律失常诱发率增高(P<0.05),金丝桃苷减少I/R后室性心律失常诱发率(P<0.05)。结论：金丝桃苷可减少因缺血再灌注导致的心室电生理特性的改变,降低缺血再灌注后室性心律失常的诱发率。第四部分：金丝桃苷减轻大鼠在体心肌缺血再灌注损伤和心肌细胞钙循环紊乱目的：观察金丝桃苷对大鼠在体心脏缺血再灌注区内心肌的保护作用,明确金丝桃苷能否减轻I/R引起的心肌细胞钙循环紊乱。方法：大鼠分组及药物干预参考第二部分,通过结扎/松解大鼠冠状动脉前降支建立在体心脏的局部缺血再灌注模型(Sham组只穿线不结扎),I/R时段为30min/2h。再灌注期结束后,经颈动脉导管记录心室血流动力学参数；心室前壁缺血区心肌取材行HE、Tunnel染色；另取各组大鼠心脏分离I/R区心室肌细胞,激光扫描共聚焦显微镜下检测心肌细胞钙火花与钙瞬变相关参数。结果：所有大鼠冠脉手术造模成功；(1)与Sham组相比,I/R组左室血流动力学心脏收缩相关指标降低,金丝桃苷减少I/R后血流动力学(P<0.05)；(2)与对照组相比,I/R组左室前壁心肌损伤严重,心肌细胞凋亡增多,金丝桃苷减少I/R后心肌损伤和细胞凋亡(P<0.05)；(3)与对照组相比,I/R区域内心肌细胞自发性钙火花频率、幅值明显增多,I/R+HYP组较I/R组钙火花频率、幅值降低(P<0.05)；(4)与对照组相比,I/R组、I/R+HYP组钙瞬变幅值降低；I/R+HYP组较I/R组钙瞬变幅值升高,(P<0.05)。结论：1.金丝桃苷可减少大鼠在体缺血再灌注模型中I/R区域内心肌细胞凋亡。2.金丝桃苷可减轻缺血再灌注导致的心肌细胞钙循环紊乱。