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已有的研究表明细胞外钙调素(CaM)存在于蚕豆保卫细胞质膜外侧并能促进气孔关闭,抑制气孔开放.而微丝骨架参与了多种细胞外信号调控的气孔运动,但还不清楚是否参与以及如何参与细胞外CaM在保卫细胞的信号转导.该研究在表皮条生物学分析的基础上,主要利用激光共聚焦显微技术,转基因技术研究了微丝骨架在细胞外CaM调控气孔运动中的作用.免疫印迹和免疫荧光定位结果表明拟南芥的保卫细胞壁存在CaM;外源CaM能够促进拟南芥气孔关闭并抑制光照诱导的气孔开放;不过膜的大分子CaM的拮抗剂W7-agarose和CaM抗血清在无外源CaM的情况下,均能抑制气孔的正常关闭,促进气孔的正常开放,说明内源细胞外CaM和外源CaM一样,也是气孔运动的一个调节因子.以表达GFP-mTn融合蛋白的转基因拟南芥为材料,利用激光共聚焦扫描技术研究了细胞外CaM对保卫细胞微丝骨架动态变化的调控作用.结果表明细胞外CaM能诱导保卫细胞微丝骨架的解聚,这种解聚作用是时间依赖的;而微丝骨架的拮抗剂细胞松驰素.D(CD)和稳定剂鬼笔环肽(Phalloidin)分别能促进和抑制细胞外CaM诱导的气孔关闭.因此推测微丝骨架的解聚参与了细胞外CaM诱导的气孔关闭,并是细胞外CaM诱导气孔关闭所必需的.细胞外CaM能诱导保卫细胞[Ca<2+>]<,cyt>升高.当[Ca<2+>]<,cyt>升高被抑制后,细胞外CaM不能诱导微丝骨架解聚和气孔关闭.这个结果表明细胞外CaM可能通过诱导保卫细胞[Ca<2+>]<,cyt>升高,来促进微丝骨架的解聚,进而导致气孔关闭.利用RT-PCR的方法克隆了拟南芥微丝解聚因子AtADF2 cDNA的全长,经过原核表达得到了AtADF2的融合蛋白并制备了其抗体.Western实验证实AtADF2在各个营养组织中都有表达,其中叶片中含量最高.免疫荧光定位结果表明ADF2存在于保卫细胞中.利用转基因技术得到了ADF2的正义和反义表达的转基因植株.ADF2的过量表达促进了细胞外CaM诱导的气孔关闭,而抑制ADF2的表达则有相反的结果,但CD的处理能消除这种抑制作用.这些结果暗示植物体内ADF2的过量表达能够促进保卫细胞微丝骨架的解聚,从而促进了气孔对细胞外CaM的反应.利用转基因技术获得了保卫细胞中AtPROFILIN1大量表达的阳性植株,生物学分析表明AtPROFILIN1的过量表达促进了细胞外CaM诱导的气孔关闭,CD不能促进转基因植株气孔对细胞外CaM的反应,而Phalloidin却能抑制这一过程.荧光标记保卫细胞中的微丝骨架,结果表明AtPROFILIN1的过量表达使得保卫细胞中的微丝骨架解聚.这些结果表明PROFILIN1的过量表达促进了保卫细胞微丝骨架,从而促进了气孔对细胞外CaM的反应.AtPROFILIN1和AtADF2的过量表达也促进气孔对光照,黑暗和ABA的反应,说明在复杂的保卫细胞信号转导中,多种细胞外信号的转导是相互交错的.在该文研究中,我们发现细胞外CaM是通过诱导保卫细胞微丝骨架的解聚来促进气孔关闭的,转基因植株的实验结果进一步证实了这一发现.CaM可能是通过诱导保卫细胞[Ca<2+>]<,cyt>升高,激活PROFILIN1,促进F-actin的解聚,或者CaM通过激活保卫细胞中的ADF2,促进F-actin解聚.