目的：对2011年重庆市采集的儿童流行性乙型脑炎患者（乙脑）标本进行病毒分离与鉴定，并分析流行性乙型脑炎病毒（乙脑病毒）分离株的分子生物学特征。方法：采集重庆医科大学附属儿童医院流行性乙型脑炎患者血液及脑脊液标本共145份，通过巢式PCR，实时荧光PCR，BHK-21细胞培养以及接种2-3日龄乳鼠等方法，检测并分离乙脑病毒，并对病毒分离株的ORF基因区及E基因进行测序。使用Clustal X（1.8）、MEGA5等生物学软件进行核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化分析。结果：本实验仅从儿童乙脑患者脑脊液标本中分离到1株乙脑病毒，命名为CQ11-66，该病毒能致2-3日龄乳鼠死亡，也能使BHK-21细胞发生细胞病变效应。CQ11-66株ORF区同其他21株乙脑病毒毒株相比，核苷酸及氨基酸序列的差异度分别介于1.68～18.46%和0.32～4.89%；同其他30株乙脑病毒毒株相比，CQ11-66株在E基因区核苷酸及氨基酸序列的差异度分别为1.69～18.74%和1.01～5,13%。CQ11-66株和疫苗株SA14-14-2相比，ORF区有201处核苷酸发生变异，42处氨基酸发生变异；在E基因区有36处核苷酸变异，导致15处氨基酸发生变异。基于CQ11-66株ORF及E基因区核苷酸序列做系统进化分析，两种方法均提示CQ11-66株属于乙脑病毒基因Ⅲ型。结论：在重庆市儿童乙脑患者标本中分离到1株乙脑病毒CQ11-66，且CQ11-66株在ORF和E基因区核苷酸序列和氨基酸序列同其他乙脑病毒离株存在一定的差异，经系统进化分析显示CQ11-66株属于乙脑病毒基因Ⅲ型。