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灵芝(Ganoderma)是一种药用价值很高的名贵真菌,灵芝三萜是其主要活性物质之一:硒是生命活动的必需元素,二者对许多疾病都有防治作用。在综合了近年来灵芝三萜类成分的化学结构、药理活性成果以及硒化合物的抗癌作用和机理,总结了灵芝三萜和硒化合物的研究现状基础之上,本实验首次尝试将三萜和硒进行有机结合,以期达到优化其生理和药理功能的目的。 首先,建立了灵芝发酵菌丝三萜类化合物含量的检测方法。即:以齐墩果酸作为标准品,用香草醛-高氯酸发色体系进行比色,确定灵芝发酵菌丝三萜含量测定的最佳反应条件:水浴挥干样品的氯仿溶液,加入0.3ml 5%香草醛-冰醋酸、1.0ml高氯酸、反应温度为70℃、反应时间为25分钟进行显色反应,光吸收波长为550nm。 其次,本实验通过生物转化将硒富集到灵芝菌丝体中。实验证明:灵芝具有较强的富硒能力,可以在400ug/g的改良PDA培养基上正常生长,菌丝体干重收获率约为1%,经过乙醇提取、氯仿萃取,得粗富硒灵芝三萜(rSeGT)的收获率约为3.97%,、进一步经硅胶柱层析,获得四种富硒灵芝三萜组分(SeGT1,SeGT2,SeGT3,SeGT4),且各组分富硒能力不同,以SeGT1富硒能力最强,为21.03ug/g。 第三,用MTT法对乙醇提取物(EEG)、氯仿萃取物(rSeGT)、及硅胶柱层析各组分(SeGT1、SeGT2、SeGT3、SeGT4)进行的体外抑瘤效果进行分析,发现除SeGT4外均对K562细胞具有抑制作用,其中以SeGT1效果最佳,作用72h抑制率达78.14%,明显比阳性对照组GT1(不富硒的三萜组分)高;形态观察可见细胞膜破损,细胞变形或出现胞芽和缢痕,透明度和亮度降低,细胞内出现有异物感的颗粒,细胞增殖被抑制,活细胞数减少:电镜下观察到:细胞皱缩变小,胞浆致密,核固缩,染色质浓集、边聚化,形成不同形状大小的块状,胞质空泡化等。DNA电泳图明显具有凋亡细胞的DNA梯度条带;流式细胞仪分析显示: