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山梨醇是一种糖醇,广泛分布于一些蔷薇科木本植物中。它是这些蔷薇科木本植物主要的光合产物、运输糖和贮藏物质,起着其它植物中蔗糖的作用。山梨醇还是一种小分子渗透物质,可以改变细胞渗透势,从而可以提高植物抗寒、抗旱、抗盐、抗硼亏缺等方面的能力。酶对山梨醇的代谢途径、代谢场所和代谢速度起关键作用,与山梨醇代谢相关的酶主要有6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)、山梨醇脱氢酶(SDH)和山梨醇氧化酶(SOX),NAD-山梨醇脱氢酶负责催化山梨醇氧化成果糖的不可逆反应。本研究克隆了苹果NAD-SDH 基因的部分cDNA 序列,构建了其反义表达载体,并正在通过农杆菌浸染法将该基因反义转化至蔷薇科植物中。旨在通过研究NAD-SDH 的反义表达,来进一步探究NAD-SDH 在山梨醇碳素代谢中的作用及山梨醇对植物抗逆性和果实风味的影响。本研究获得的成果主要有: 1.优化了富含多糖多酚苹果果实总RNA 的提取方法。发现用等体积的异丙醇沉淀RNA 比用LiCl 好,同时加入8%PVP 和1%巯基乙醇就能抑制酚类物质的氧化。2.从苹果果实中克隆出一个NAD-SDH cDNA 片段,长377bp,编码125 个氨基酸,命名为NAD-SDH8。根据核苷酸及氨基酸序列分析表明,该片段与Genbank 中NAD-SDH基因家族其它成员有很高的同源性,最高达99%,证明该片断是NAD-SDH 基因家族的一个新成员, 并登录Genbank ( AY707458 )。该片段含有一个特征序列G–H–E–X(2)–G–X(5) –[G/A]-X(2)-[I/V/S/A/C]、含锌的乙醇脱氢酶家族典型的保守序列、Zn 的催化位点和结构位点、NAD 的结合位点等,这些特征说明该片段属于醇脱氢酶基因家族。对NAD-SDH 进行分子进化分析,发现NAD-SDH 有两个分支,且NAD-SDH8与枇杷中NAD-SDH 序列有最近的进化距离。3.构建了pSB166-NAD 反义表达载体,并通过直接转化法将其转化农杆菌EHA105,经测序、PCR 检测,含有目的反义片段的质粒已经导入农杆菌细胞中。