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许多病毒利用不同的机制产生非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）,主要包括由RNA聚合酶II或III转录而成的ncRNA和通过细胞5’-3’核酸外切酶不完全降解产生的亚基因组ncRNA。这些ncRNA在病毒的生活周期和病毒-宿主互作中发挥着非常重要的作用,包括自动调控病毒基因的表达、改变细胞周期、以及逃避宿主的防卫反应等。至今,大多已发现的病毒ncRNA是由DNA病毒所编码的,除黄病毒属病毒和少数植物病毒外,由RNA病毒产生的ncRNA鲜有报道,目前尚未有关冠状病毒编码ncRNA的报道。禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）,Gamma冠状病毒属的成员,是一种具囊膜的单股正链RNA病毒。在感染细胞中,IBV通过由基因组5’-端的转录调控序列（TRS）中和编码结构蛋白和辅助蛋白基因前的保守核心序列CU（U/G）AACAA介导的、以非连续转录机制合成5条亚基因组RNA（sgRNA）,编码病毒的结构蛋白和辅助蛋白。在本研究中,我们首次发现并鉴定了由IBV产生的一条ncRNA;利用反向遗传学技术获得病毒突变体,揭示了该ncRNA的形成机制,定位了影响ncRNA形成的关键核苷酸;通过分子生物学技术和转录学分析对该ncRNA的生物学功能进行了初步研究。结果如下:1、在IBV感染的Vero细胞和鸡胚中,通过RT-PCR检测,发现IBV能产生一条小的新sgRNA。克隆后测序,序列分析结果显示,该sgRNA全长563 nt（不包括poly（A）尾）,由IBV基因组长63 nt的5’-端前导序列和3’-UTR（27104-27608 nt）组成。由于其不含起始密码子AUG,故为一ncRNA。2、为了揭示ncRNA的形成机制,定位影响ncRNA形成的关键核苷酸,我们以IBV-p65为遗传背景,利用已建立的IBV反向遗传学体系,构建并获得了一系列重组病毒,并对其生物学特性进行了分析,结果如下:（1）将EGFP的ORF插入IBV基因组3’-UTR 27149-27150 nt间,获得的重组病毒感染细胞后,可检测到EGFP的表达,证实该ncRNA是一条mRNA。（2）通过缺失、点突变,构建并获得重组病毒IBV-U27104A、IBV-A27105U、IBV-A27106U、IBV-C27107G、IBV-A27108U、IBV-Δ27104-08和IBV-A27110U/A27111U/G27113C/G27114C。RT-PCR检测这些病毒感染细胞中的ncRNA。结果显示,点突变U27104A和A27108U对ncRNA的合成无显著影响,点突变A27105U和A27106U导致ncRNA的合成显著减少,而点突变C27107G和Δ27104-08完全阻碍了正链和负链ncRNA的合成。结果说明,至少3个核苷酸（A27105/A27106/C27107）为ncRNA的有效合成所必需。此外,位于非标准核心序列(27104UAACA27108)下游的A27110/A27111/G27113/G27114与前导序列中核心序列下游序列保守。当用含有4个点突变的重组病毒IBV-A27110U/A27111U/G27113C/G27114C感染细胞后,在感染细胞中未能检测到ncRNA的合成,显示这4个核苷酸对ncRNA合成也至关重要。综上所述,该ncRNA是由非标准核心序列27104UAACA27108介导的、通过非连续转录机制转录而产生的,至少3个核苷酸（A27105/A27106/C27107）为ncRNA的有效合成所必需,且位于非标准核心序列（27104UAACA27108）下游的A27110/A27111/G27113/G27114对ncRNA合成也至关重要。3、ncRNA对病毒复制和致病性的影响（1）噬斑试验结果发现用IBV-rIBV和IBV-C27107G病毒感染Vero细胞形成的CPE直径分别为1.27±0.18和1.23±0.22mm,两者无显著差异。（2）荧光定量RT-PCR分析2种病毒感染Vero细胞8h和20h时S基因和N基因表达水平,结果显示两者无明显差异。（3）Western blot分析2种病毒感染4h、8h、12 h、16 h、20 h、24 h和28h时S蛋白和N蛋白的表达量,发现两组之间差异不显著。由以上结果可知,ncRNA对病毒在Vero细胞的复制和致病性无显著性影响。4、ncRNA对宿主基因表达的调控（1）初步的RNA微阵列分析结果表明ncRNA在宿主基因的表达中起着重要作用。rIBV感染Huh7后LBP和VNN3基因分别上调2.50和3.29倍,IBV-C27107G感染Huh7后LBP和VNN3基因分别上调14.43和9.64倍,表明不产生ncRNA,LBP和VNN3基因的转录在Huh7细胞中增强,ncRNA的产生反而削弱了这种增强作用。（2）荧光定量PCR显示,rIBV感染DF-1细胞16h时Mda5和IFN-β分别增长7.97和20.11倍,IBV-C27107G感染DF-1细胞16h时,增长倍数为13.64和46.37,但在Huh7细胞中,均没有显著差异,表明细胞种类不同,抗病毒反应机制存在较大差异。以上结果表明,ncRNA不仅影响宿主细胞某些基因的转录,对宿主固有的抗病毒反应也有影响。5、为了进一步明确ncRNA的功能,对rIBV和IBV-C27107G分别感染DF-1细胞24h后的RNA样品进行了转录组学分析,结果如下:（1）转录组测序共筛选出1357个差异表达基因,其中上调的有740个,下调的有617个。其中1255个基因在数据库中得到了注释,分别是COG 466个、GO 1140个、KEGG 775个、KOG 823个、NR 1226个、Swiss-Prot 1181个及eggNOG 1235个。（2）挖掘1522个新基因。其中770个新基因的功能得到注释,具体为COG122个、GO 224个、KEGG340个、NR 518个、Swiss-Prot252个及eggNOG 738个。（3）在转录组测序筛选的1357个差异表达基因中,775个在KEGG数据中得到注释,其中584个位于KEGG最主要的6大生物反应中,其中参与环境信息处理的有14条通路共162个基因,参与细胞进程的有9条通路共116个基因,参与生物系统的有11条通路共101个基因,参与代谢的有8条通路共77个基因,参与分类疾病的仅有3条通路共50个基因,还有参与遗传信息处理的5条通路48个基因。