论文部分内容阅读
荚膜是某些细菌在细胞壁外周产生的一种黏液样物质。荚膜多糖对猪链球菌的感染与致病有非常重要的作用,根据荚膜多糖抗原性不同可将猪链球菌分成33个血清型,每个血清型的荚膜多糖都是由糖苷键连接寡糖重复单元而成的结构不同的多糖。荚膜多糖的产生是一个复杂过程,是细菌基因组中多个基因表达的糖基转移酶、乙酰转移酶、多糖合成酶和翻转酶等共同作用的结果,这些基因被称为荚膜多糖合成相关基因簇。研究此基因簇的形式和组成,能够更好地理解猪链球菌荚膜多糖的合成途径、多样性产生原因等；并且可在此基因簇中筛选血清型特异性基因,建立适于大量样品检测的分子生物学定型方法。结合荚膜多糖的组成,也将为揭示某些血清型交叉抗原性产生的原因奠定基础。1.猪链球菌荚膜多糖合成相关基因簇保守区的克隆与分析在分析已知的猪链球菌1、2、7、9型荚膜多糖合成相关基因簇序列,及其各orf与猪链球菌33个血清型基因组DNA杂交结果的基础上,提出猪链球菌荚膜多糖合成相关基因簇具有与肺炎链球菌相似的盒样(cassette-like)结构的假设。并采用PCR、测序和Southern印迹杂交等方法验证这些假设。结果显示,猪链球菌的荚膜多糖合成相关基因簇确存在与肺炎链球菌相似的盒样结构,5’端的前四个调节相关基因同源性极高,基因簇两端都有保守的侧翼基因,且在3’端的侧翼序列中找到了适于扩增荚膜多糖合成相关基因簇中血清型特异性区域的下游引物所在基因(aroA)。同时分析了各血清型的orfY、orfX、cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和aroA的进化关系。2.猪链球菌15个血清型荚膜多糖合成相关基因簇的基因分析通过长片段PCR方法扩增猪链球菌14个血清型(1、3、4、5、7、8、9、10、14、16、19、23、25和1/2型)的荚膜多糖合成相关基因簇内的下游基因,鸟枪法测序并拼接成完整的荚膜多糖合成相关基因簇,并与已知的2型此基因簇相比较。这些血清型的荚膜多糖合成相关基因簇可分为2个组的基因型。血清型特异性基因位于基因簇的中间区域,包含糖基转移酶、乙酰转移酶、磷酸转移酶、氨基转移酶、甘油磷酸转移酶、金属蛋白酶,丙酮酰转移酶、多糖转移酶和翻转酶等。这些基因簇的3’端翻译某些IS转座酶。猪链球菌1、2、14、16和1/2型中,有5个蛋白(NeuA,B,C,D和唾液酸转移酶)与唾液酸的合成直接相关。15个基因簇中所有orf翻译蛋白以TribeMCL算法可归为127个同源组。这些血清型荚膜多糖合成相关基因簇的形式,提示猪链球菌的荚膜多糖是通过Wzy依赖途径合成的。同时,比较15个血清型中具有交叉抗原性的细菌的荚膜多糖合成相关基因簇,探讨猪链球菌荚膜多样性产生的机制。3.猪链球菌3、4、5、8、10、16、19、23、25型等9个血清型PCR检测方法的建立及应用除猪链球菌1(14),2(1/2),7和9型外,其余血清型至今无简单快速的PCR检测方法可用,仅能使用耗时费工的血清凝集方法进行定型。随着人和动物感染猪链球菌的血清型越来越复杂,迫切需要建立快速敏感的检测方法来解决临床诊断中的诸多问题。本文基于交叉杂交试验的结果,筛选9个血清型(3、4、5、8、10、16、19、23、25)的血清型特异性基因,并在此基础上建立了这些血清型的PCR检测方法,对199株各血清型的猪链球菌临床分离株进行检测,同时利用血清凝集方法进行定型。这些PCR方法的检测结果与经典的血清凝集方法一致,不仅能检测参考菌株,而且能检测临床分离株,并可直接应用菌液作为模板进行检测,血清学不能鉴别的菌株鉴定中也有一定作用,对猪链球菌的检测、鉴定有重要意义。4.猪链球菌1、2、14、1/2型荚膜多糖的单糖组成比较研究猪链球菌1、2、14和1/2型间存在单向或双向的交叉抗原性,这种交叉抗原性的产生原因至今未被揭示。采用Sephacryl S-300凝胶层析柱对猪链球菌14和1/2型荚膜多糖进行分离纯化,经苯酚-硫酸检测和dot-ELISA辅助鉴定,确定荚膜多糖成分。采用高效凝胶渗透色谱法测定14和1/2型猪链球菌荚膜多糖分子量分别为487.38 kD和512.72 kD。经柱前衍生高效液相色谱法、荧光标记液相色谱法和核磁共振测定14和1/2型猪链球菌荚膜多糖单糖组成分别为：Glc/Gal/GlcNAc/Rha/Neu5Ac (1:2.94:1.35:0.24:0.37)和Glc/Gal/GlcNAc/GalNAc /Rha/Neu5Ac (1:1.67:1.05:0.93:0.72:0.7).并与已知的猪链球菌1、2型荚膜多糖的单糖组成进行比较分析,发现4种血清型荚膜多糖都具有Glc. GlcNAc.Gal和Neu5Ac,但单糖组成和比列并无明显相似性,这种交叉抗原性可能是由于荚膜多糖的空间结构相似性和(或)细胞表面的其他成分引起的。