肝纤维化是一种由各种病因长期损伤肝脏,从而导致肝脏反复发生损伤-修复反应的一种慢性肝脏疾病。大量细胞外基质(ECM)在这个病理过程中分泌、聚集,最终导致了肝纤维化和肝硬化的发生。静息的肝星状细胞(HSC)具有储脂、维持肝脏内维生素A内稳态的功能,但当它一旦被致纤维化因子激活后,就成为了产生ECM的主要效应细胞。活化的HSC能够表达很多致肝纤维化的细胞外基质蛋白,如:Ⅰ型胶原、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶(MMP)、金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)等。临床研究证明慢性乙肝病毒(HBV)感染是导致我国肝炎、肝硬化甚至肝癌的最主要病因。HBx蛋白作为乙肝病毒的四种编码蛋白之一,在肝脏疾病的发生发展中发挥了关键的作用。HBx蛋白作为一个多功能调节蛋白,具有广泛的反式激活作用,它能通过与其他转录因子直接或间接的相互作用参与感染肝细胞的基因组稳定性、细胞凋亡、蛋白降解、信号转导和细胞周期调控,在HBV的复制、致病和致癌机制中具有重要作用。TGF-β1被认为是在肝纤维化的病理过程中激活HSC的主要细胞因子。检测HBV相关的纤维化肝脏标本,或是转染了HBx的肝细胞的条件培养基,均可发现TGF-β1表达显著增高。研究发现在肝癌细胞中,HBx能够通过与TGF-β1基因启动子的Egr-1位点结合从而在转录水平上激活TGF-β1的表达。CD147分子是一个跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族的一员。它广泛的表达于各种炎癌组织,而在正常组织中不表达或低表达。我们之前的研究证实了该分子高表达于人类肝硬化组织的窦周隙和tgf-β1刺激后的肝星状细胞,但其具体的调控和分子机制尚未得到揭示。在本研究中,我们提出了以下假设:hbv感染肝细胞后,hbx刺激肝细胞旁分泌tgf-β1,tgf-β1与hsc的tgf-β1受体结合后,活化经典的smad信号通路,诱导cd147表达;cd147表达上调激活hsc,促进hbv相关肝纤维化的发展。为了证明这个假设,我们的研究分为以下3部分:第一部分:hbx通过促进tgf-β1旁分泌上调cd147活化hsc。hbx转染人非肿瘤肝细胞系l02,建立稳转hbx的l02-hbx细胞系。该细胞系中,不论tgf-β1的总分泌量还是活性tgf-β1量均显著增高(p<0.001)。为了证明hbx对hsc的作用,我们将l02-hbx细胞与人肝星状细胞系lx-2共培养或以l02-hbx细胞的条件培养基孵育lx-2细胞后,westernblot检测到lx-2细胞的cd147表达上调。而此条件下的cd147上调表达可被tgf-β1受体阻断剂(sb-431542)所抑制。这证明hbx通过旁分泌tgf-β1诱导肝星状细胞cd147分子表达上调。为了证明tgf-β1能够诱导hsc的cd147分子的表达,我们以不同浓度的tgf-β1刺激lx-2细胞后,发现cd147及纤维化相关分子α-sma、α1(i)collagen、mmp-2在mrna水平和蛋白水平均呈剂量依赖性升高。为了进一步明确cd147在激活hsc的的过程中发挥着重要的作用,我们将cd147转染lx-2细胞,建立稳转cd147的lx-2-cd147细胞系,发现该细胞系中不论是上述纤维化相关分子在mrna和蛋白水平的表达上,还是细胞迁移能力(transwell小室检测)、收缩能力(细胞收缩实验检测)都有显著增强。此外,我们还发现ellisa检测lx-2-cd147细胞上清后,tgf-β1的总量和活性tgf-β1均显著上调。上述结果表明,hbx蛋白通过旁分泌tgf-β1上调hsc的cd147,cd147的上调活化了hsc,从而使ecm的合成增加,促进肝纤维化的进展。在这个过程中,存在着cd147-tgf-β1的正反馈环路。第二部分:hbv转基因小鼠(hbv-tgmice)纤维化模型中cd147表达上调促进肝纤维化。不同于以往的ccl4诱导、胆管结扎等单因素小鼠肝纤维化模型,本实验采用了hbv-tg小鼠模拟人类感染hbv引起的hbv相关肝纤维化。在hbv-tg小鼠模型肝脏组织中,westernblot和免疫组化结果均显示该小鼠表达hbx蛋白;我们发现12个月的hbv-tg小鼠肝脏外观明显肿大,并出现不规则的结节,肝脏重量明显高于wt小鼠。检测6个月hbv-tg小鼠的肝脏组织,h&e染色显示,hbv-tg小鼠的肝脏组织有严重的小叶中心坏死伴中性粒细胞和单核巨噬细胞的浸润;天狼星红和masson三色染色均显示胶原沉积,假小叶形成。westernblot和/或免疫组化检测肝纤维化相关分子α-sma、α1(i)collagen、mmp-2均表达上调。这些结果说明hbv-tg小鼠在6个月即可发生自发肝纤维化。为了在体内验证hbv相关的肝纤维化在hsc存在cd147、tgf-β1之间的正反馈调节,westernblot和免疫组化检测hbv-tg小鼠肝脏显示cd147和tgf-β1均高表达。免疫荧光检测显示,在hbv-tg小鼠肝脏组织中cd147、α-sma、tgf-β1存在三者的共定位。上述结果提示在hbv相关肝纤维化的hsc中,可能存在cd147与tgf-β1之间的正反馈调节。第三部分:在hsc中tgf-β1通过smad信号途径上调cd147。以不同浓度tgf-β1刺激lx-2细胞系,发现smad2、smad3的蛋白总量没有发生改变,但p-smad2、p-smad3表达增高。检测hbv-tg小鼠肝脏组织的smad2、smad3、p-smad2、p-smad3同样验证了这一点。tgf-β1刺激前后,smad4在hsc中的表达量无明显变化,这一点在hbv-tg小鼠中同样得到了证实;但是激光共聚焦检测发现smad4在hsc中的定位随着tgf-β1浓度的增加,逐渐从胞浆向细胞核内聚集。为了证明smad信号途径对cd147的调控功能,我们分别以si-smad2、si-smad3、si-smad3作用于lx-2细胞,westernblot检测发现相应的smad被干涉后,cd147的表达均显著下调。这些结果说明tgf-β1是通过smad蛋白协同作用诱导了cd147的表达。为了验证smad4能够直接在转录水平调控cd147的表达,我们在lx-2细胞中共转染了cd147启动子、smad4和pgl3-basic质粒。双荧光素酶报告基因实验提示荧光活性与smad4的剂量呈正相关,这证明smad4可以在转录水平调控cd147的表达。为了明确smad4调控cd147的具体结合位点,我们将cd147启动子全长1761bp,及上游1273bp、1028bp、644bp、338bp的荧光素酶分段截短载体与smad4表达载体共转染入lx-2细胞,实验结果表明,smad4是通过结合启动子-644到-338区间的sbe(smadbindingelement)来调控cd147转录。为了进一步证明这一点,我们将这一区域sbe的gtct突变为ggcg,发现突变后的cd147启动子的荧光活性没有上升。染色质免疫共沉淀(chip)也证实,转录因子smad4可以直接调控cd147表达。上述结果证明,tgf-β1通过调节hsc内smad2/3的磷酸化和Smad4的定位,影响着CD147的转录调控;而Smad复合体通过Smad4与CD147启动子的-644到-338区的SBE直接结合来调控CD147的转录表达。