【摘 要】
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目的:非酒精性脂肪肝疾病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是慢性肝病的常见原因,由于脂蛋白组装或运输的缺陷,NAFLD的发生通常与肝中甘油三酯的增加和胰岛素抵抗有关。本文旨在探讨在肝脏中高尔基体糖蛋白GP73（Golgi Protein 73,GP73）的高表达对肝脏脂代谢的影响,阐明其通过GAP活性抑制Apo B的分泌来调控脂代谢的分子机制,为NA
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目的:非酒精性脂肪肝疾病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是慢性肝病的常见原因,由于脂蛋白组装或运输的缺陷,NAFLD的发生通常与肝中甘油三酯的增加和胰岛素抵抗有关。本文旨在探讨在肝脏中高尔基体糖蛋白GP73（Golgi Protein 73,GP73）的高表达对肝脏脂代谢的影响,阐明其通过GAP活性抑制Apo B的分泌来调控脂代谢的分子机制,为NAFLD的诊断和治疗提供潜在的靶点。方法:1.分组给予小鼠高脂饮食（HFD）0、3、7天,通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹的方法分别检测高脂饮食的摄入对小鼠肝脏GP73在m RNA和蛋白水平上的表达影响。2.将肝细胞特异性腺相关病毒（AAV）的空载体（AAV-V）和高表达GP73的AAV（AAV-GP73）注射到小鼠尾静脉中,给予常规饮食（Reg）或高脂饮食（HFD）;通过测定空腹血糖、空腹胰岛素水平、糖耐量实验来评估监测小鼠糖代谢情况;模型构建成功后,采用酶联免疫吸附法测定小鼠肝中TG、CHO水平;采用蛋白免疫印记法检测小鼠肝中GP73、Apo B、Apo E的表达水平;采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中TG、CHO、低密度脂蛋白（LDL）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平;采用苏木素伊红染色、油红O染色检测小鼠肝细胞形态和肝中脂质累积程度。3.使用转录组基因芯片技术来测定导致血脂异常表型的分子改变,以比较GP73高表达小鼠和对照组小鼠肝脏的转录组差异。4.通过Elisa方法检测WT GP73和GP73-RQ在细胞中高表达对载脂蛋白分泌的影响。5.将AAV-V、AAV-GP73和高表达GP73-RQ的AAV（AAV-GP73-RQ）注射到小鼠尾静脉中构建GP73 GAP活性模型;通过测定空腹血糖、空腹胰岛素水平、糖耐量实验来评估监测小鼠糖代谢情况;模型构建成功后,采用酶联免疫吸附法测定小鼠肝中TG、CHO水平;采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中TG、CHO、LDL、ALT、AST的水平。结果:1.小鼠肝脏中GP73在m RNA上的水平随着给予高脂饮食的时间正常而增高,而在高脂饮食第7天时,肝脏中GP73的蛋白水平开始增高。2.在整个观测过程中,AAV-GP73小鼠表现出空腹血糖升高、空腹胰岛素降低和糖耐量实验异常;通过免疫蛋白印迹检测AAV-GP73的小鼠中证实了肝脏GP73的高表达,而AAV-GP73小鼠肝脏中Apo B100表达显著增加;Elisa检测无论是常规饮食还是高脂饮食,在AAV-GP73小鼠肝脏中TG、CHO含量明显高于对照组,通过称量发现肝脏比重也高于对照组;在常规饮食中,油红O染色发现AAV-GP73小鼠肝脏中红色脂滴明显多于对照;而在高脂饮食中,AAV-GP73小鼠肝脏明显发黄肿大,HE染色发现其肝细胞有明显的气球样变和损伤;通过全自动生化分析仪检测,在相比较于对照组AAV-V,AAV-GP73小鼠中,血清TG、CHO酯显着降低,而ALT、AST显著升高。3.在转录组基因芯片中,肝细胞的GP73过表达（表达变化1.5倍,调整后的p值<0.05）使所有基因中的20%的表达有差异;在以常规饮食喂养的GP73高表达小鼠中,它影响的上调基因与HFD喂养的对照小鼠中上调的基因种类极其相似;在AAV-GP73高小鼠的肝脏中,与脂肪酸分泌、脂肪酸从头合成和NAFLD、与糖异生和胰岛素抵抗有关的基因有均显着增加,与葡萄糖代谢异常有关的基因在肝GP73高的小鼠中差异表达;且GP73高小鼠的肝脏中,与肿瘤发生有关的基因的水平也明显高于对照小鼠。4.细胞实验中WT GP73抑制了Apo B和Apo B100的分泌,而GP73-RQ突变体与对照组差别不大,Apo A1的分泌不受WT GP73或GP73-RQ的影响,而WT GP73促进了Apo E的分泌。5.GP73 GAP活性模型中,在整个观测过程中,肝GP73-RQ突变体高表达小鼠并未像WT GP73小鼠表现出明显的空腹血糖升高、空腹胰岛素降低现象;Elisa检测在AAV-GP73小鼠肝脏中TG、CHO含量明显高于对照组,而AAV-GP73-RQ与对照AAV-V小鼠相差不大;AAV-GP73小鼠血清中TG、CHO显着降低,ALT、AST显著升高,而AAV-GP73-RQ小鼠血清中TG、CHO与对照差异不大,但ALT、AST相比对照依然升高。结论:通过以上结果,我们发现高脂饮食能够上调肝脏中GP73的异常表达,而肝中高表达GP73可以通过抑制Apo B的分泌来影响脂代谢,导致机体严重的脂质紊乱;进一步研究发现,缺少GAP活性的GP73突变体则无此类功能改变,证明GP73调控脂代谢和部分糖代谢是通过其GAP活性实现的。
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