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抗体药物因特异性高、治疗癌症等疑难疾病效果好被广泛应用于生物医疗领域。现今,常被用来进行抗体分离纯化的技术为蛋白A亲和层析,但成本高、洗脱条件苛刻等不利因素限制了该技术的进一步发展。短肽仿生层析技术是一种新型抗体分离纯化技术,可通过仿生蛋白A的关键残基部位保有与目标蛋白高特异性结合的特性。短肽配基作为该技术的功能配基相较蛋白A配基而言有诸多优势,如制备流程更简单、稳定性更好、生产成本更低,即便短肽配基脱落其小分子结构也不易引起免疫应答。本文以短肽仿生层析为研究主题,考虑蛋白A关键残基部位的作用关系,选择四肽作为仿生层析介质的作用配基,建立四肽配基库,分析层析介质中空间臂作用,研究关键作用位置配基性能,筛选并优化出具有良好抗体分离性能的四肽配基,使蛋白A关键残基部位的结构和功能上的效果得以在仿生四肽中被充分展现,进而完善四肽仿生层析。主要的研究内容和结果如下:首先,使用分子模拟技术初步筛选四肽配基。先采用理性设计方法,得到了含480个四肽配基的配基库。随后,通过LibDock刚性对接技术从配基库中筛选得到了五种高LibDock分数的四肽配基,分别为FYKH、YEHF、FKHE、YFLH和FYHI。再通过分子动力学模拟技术,模拟了这五个四肽配基与IgG的Fc-A片段的相互作用情况。模拟结果显示,在最后5ns内,除FKHE四肽配基外,其余四种四肽配基的结合范德华力都高于静电作用力,即特异性结合能力较强。其中,YEHF拟合得到的范德华力数值最高（-248.2 kJ/mol）,可以初步被认定为最优的四肽配基。该分子模拟结果是后续实验验证以及进一步配基筛选和优化的重要依据。其次,以己二胺为空间臂,琼脂糖4FF为基质,制备得到了接枝这四种四肽配基的层析介质,分别为 Ac-FYKH-4FF、Ac-YEHF-4FF、Ac-YFLH-4FF 和 Ac-FYHI-4FF介质。实验测定了在pH 5.0-8.0条件下,四种介质吸附目标蛋白hIgG和BSA的静态吸附性能和动态吸附载量。结果表明,这四种介质都有较好的吸附性能。通过比较发现,Ac-YEHF-4FF介质具有最佳的吸附性能,可以认为是这几种介质中分离纯化抗体能力最优的四肽介质,其在pH 7.0条件下可得最高的hIgG静态吸附载量（Qm=106.8mg/g介质,Kd=0.055mg/ml）,同时其BSA静态载量（Qm=52.6mg/g介质,Kd=5.43mg/ml）较低。动态吸附实验表明,Ac-YEHF-4FF介质在pH 7.0、100 cm/h流速时,Q10%-hIgG值可高达26.17mg/ml,而此时其Q10%-BSA值仅为2.25mg/ml。因此,不论是静态吸附结果还是动态吸附载量显示,Ac-YEHF-4FF介质都表现出较好的吸附选择性。用该介质分离hIgG与BSA蛋白混合料液时发现,在温和条件下进行介质吸附和洗脱实验,可一步分离得到纯度为97.8%,收率为99.2%的hIgG料液。分离结果的两个关键指标纯度和收率均超过了 95.0%,表现出Ac-YEHF-4FF介质较好的抗体分离纯化能力。其三,使用表面等离子共振技术深入研究了四肽配基Ac-YEHF与目标蛋白的相互作用情况。测定了不同pH值与不同hIgG和BSA的浓度下,偶联于金箔片上Ac-YEHF配基实际吸附两种蛋白质的能力。结果表明,在pH 6.0条件下,Ac-YEHF配基的hIgG吸附载量可达7.69mg/m2,是文献报道的最优六肽吸附载量的2.05倍,最优七肽吸附载量的1.73倍,且此时Ac-YEHF配基的Kd值仅为0.081 mg/ml,展现出该配基良好的吸附性和亲和力。相较于文献报道的较优短肽配基,Ac-YEHF具有更低的制备成本、更稳定的吸附性能、更高的hIgG吸附载量以及更易分析的与目标蛋白的相互作用力情况。其四,引入长链多支链聚合物聚乙烯亚胺（PEI）作为短肽仿生层析空间臂,制备了以PEI为空间臂,Ac-YFRH和Ac-YEHF为配基的两种介质。结果显示,四肽配基相同情况下,随pH值的变化,以PEI为空间臂的四肽介质与以己二胺为空间臂的四肽介质吸附目标蛋白的变化规律相同。与此同时,PEI对两种四肽配基结合目标蛋白的作用效果不同,Ac-YFRH四肽配基更适合以PEI为空间臂,而Ac-YEHF四肽配基更适合以己二胺为空间臂。最后,通过实验进一步测定了 Ac-YEHF-4FF介质分离纯化实际料液的能力,选择的分离对象为hIgG和HSA混合蛋白、CHO细胞上清液、人血清和牛血清这四个体系。结果显示,该四肽介质在分离纯化实际料液时,均具有较高的分离纯化能力。分离hIgG和HSA混合蛋白、人血清时,其hIgG的纯度和收率分别为96.1%和97.4%、95.6%和96.8%。分离CHO细胞上清液时得到的mAb纯度和收率分别为94.3%和97.5%。分离牛血清时发现,第一步用pH5.0磷酸盐缓冲液洗脱,可得bIgG纯度和收率分别为98.4%和57.1%,再用pH 4.0磷酸盐缓冲液进行二次洗脱,可得总bIgG纯度和收率分别为88.3%和93.7%。此外,还简单考察了介质吸附禽类血清中IgY的能力,也显示了良好的吸附分离结果,说明该介质也可用于分离纯化禽类血清料液。综上所述,本文从四肽仿生层析介质的设计和制备出发,得到了可分离纯化抗体的四肽层析介质,其吸附和分离结果充分说明通过合理选择四肽,可以实现仿生蛋白A关键残基部位功效的目的,对建立和完善四肽仿生层析技术具有重要的意义,也为抗体分离纯化领域提供了一种新的方法。