铬污染是目前未能解决的世界环保难题之一,铬酸盐行业长期被列为我国严重污染行业之首。流行病学调查研究发现,长期铬暴露可以显著提高肺癌的发病率。53BP1作为抑癌基因p53的结合蛋白,是DNA损伤修复关键标志蛋白之一,其表达异常与肿瘤的发生和发展有关。课题组前期发现六价铬[Cr(VI)]急性暴露可造成明显的DNA损伤,且抑制了 53BP1的表达。本研究采用蛋白质组学和毒理学技术分析在Cr(VI)诱导的DNA损伤中组蛋白修饰与53BP1的相互作用,初步阐明Cr(VI)的毒性作用机制和分子机理,为促进职业性肺癌的预防、诊断及治疗策略的发展提供新思路。本论文主要开展了以下三部分的研究工作:1.蛋白质组学筛选及验证Cr(VI)急性暴露下组蛋白乙酰化修饰对53BP1的影响培养正常人支气管上皮细胞(16HBE),采用0 μmol/L和5μmol/L Cr(VI)染毒24h后,通过酸法提取组蛋白、二向胶分离、质谱检测等鉴定和分析差异组蛋白修饰,通过免疫印迹(Westernblot)技术对关键组蛋白的表达进行验证,染色质免疫共沉淀(CHIP)检测53BP1启动子区域特异组蛋白修饰水平的变化。研究发现:质谱结果显示,在H2A、H3和H4上均存在差异组蛋白修饰,进一步结合文献对H3乙酰化位点进行验证发现两个关键组蛋白:H3K18和H3K27 乙酰化(H3K18ac、H3K27ac)。CHIP结果显示,53BP1 启动子区的H3K18ac、H3K27ac水平下降,提示Cr(VI)急性暴露致DNA损伤中53BP1的表达受到抑制可能与H3K18ac和H3K27ac的表达下调有关。2.构建细胞恶性转化模型分析Cr(VI)慢性暴露引起的DNA损伤以16HBE细胞为研究对象,使用梯度浓度Cr(VI)(0、0.625、1.25、2.5 μmol/L)染毒处理,通过软琼脂克隆和裸鼠成瘤试验鉴定细胞恶性转化模型是否构建成功,划痕试验和Transwell试验检测转化细胞的侵袭迁移能力。采用单细胞凝胶电泳试验检测细胞DNA损伤情况,Western blot检测细胞中53BP1的表达水平。研究发现:软琼脂克隆与裸鼠成瘤试验结果显示,2.5 μmol/LCr(VI)染毒16HBE细胞15W后,细胞恶性转化成功。进一步的迁移侵袭实验证明转化细胞具有肿瘤细胞特征。单细胞凝胶电泳实验说明Cr(VI)慢性暴露下细胞受到不同程度的DNA损伤,且呈剂量效应关系。Western blot结果显示,2.5 μmol/L剂量组53BP1的相对表达明显低于对照组,且差异具有统计学意义(p<0.01)。结果显示Cr(VI)慢性暴露可造成明显的DNA损伤,且可能通过抑制53BP1的表达导致细胞DNA损伤得不到及时修复进而诱导细胞恶性转化。3.细胞恶性转化模型中Cr(VI)慢性暴露致组蛋白乙酰化修饰水平的表达变化使用梯度浓度Cr(VI)染毒处理16HBE细胞15W后,采用Western blot和细胞免疫荧光对关键组蛋白H3K18ac、H3K27ac水平进行检测。研究发现:Western blot结果显示,慢性染毒处理15W后细胞中H3K18ac、H3K27ac水平明显下降,与急性染毒结果一致。细胞免疫荧光结果显示,组蛋白H3K18和H3K27主要分布在细胞核中。Cr(VI)暴露15W后,细胞核中两者的蛋白含量减少,荧光亮度显著降低,与Western blot结果一致。推测Cr(VI)可能通过对组蛋白乙酰化水平的影响进而抑制了 53BP1 的表达,导致DNA双链修复过程紊乱,DNA损伤无法得到及时修复。