Pannexin-1对星形胶质细胞释放细胞因子及谷氨酸的影响研究背景星形胶质细胞作为中枢神经系统内数量最多的胶质细胞,具有支持、营养神经元,维持内外环境中pH值、神经递质及离子浓度稳定,接收、处理、传递信号及免疫调控等功能,其形态及功能的异常将会引起中枢神经系统内环境平衡的紊乱,导致疾病的发生与发展。缝隙连接(Gap junctions, GJs)是相邻细胞间重要的连接通道,几乎存在于所有动物的细胞膜上,能够允许小分子及离子在相邻细胞间进行转运,在细胞间信号传导、细胞的增殖与分化、免疫炎症及缺血缺氧性损伤等生理和病理过程中起重要作用。Pannexins (Panxs)是2000年新发现的缝隙连接蛋白家族,Panx-1作为Panxs蛋白家族中的重要成员之一,在中枢神经系统内分布广泛,可以在星形胶质细胞的细胞膜上形成半通道,能够允许分子量低于1kDa的小分子物质如离子、代谢分子、第二信使(Ca2+、ATP等)及神经递质通过。研究发现,Panx-1蛋白的功能与经典的缝隙连接蛋白Connexins (Conxs)存在部分重叠,且多种Conxs的拮抗剂也可作用于Panx-1,因此Panx-1可能执行了部分既往认为是属于Conxs的功能,如细胞间的信号传递、细胞因子及谷氨酸的释放等。中枢神经系统免疫炎症反应及兴奋-抑制环路的失衡参与了脑血管病、癫痫及神经系统退行性病变等多种神经系统疾病的发生与发展。因此,明确Panx-1对星形胶质细胞释放细胞因子及谷氨酸的影响将为进一步明确以上神经系统疾病的发病机制打下基础。在研究中我们同时观察到处于分裂增殖期的人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87 malignant glioma cells, U87-MG) Panx-1蛋白表达增高,星形胶质细胞增生作为星形胶质细胞激活的一种形式,将会导致星形胶质细胞电生理及生物学功能发生改变,因此我们采用siRNA细胞转染技术观察Panx-1对星形胶质细胞增殖能力的影响。材料与方法本研究共分两部分：第一部分：在体外培养的星形胶质细胞U87-MG上,采用免疫细胞化学技术观察Panx-1蛋白的表达与分布；采用siRNA细胞转染技术下调U87-MG中Panx-1的表达,脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)及腺嘌呤核苷三磷酸(Inositol 1,4,5-trisphosphate, ATP)干预U87-MG, Real-time PCR及Western Blot检测Panx-1表达水平,酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)及液相蛋白悬浮芯片(Bio-Plex(?) suspension array system)同步测定细胞外液中细胞因子(IL-1p、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α)水平,高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)检测细胞外液中谷氨酸浓度的变化。第二部分：在体外培养的星形胶质细胞U87-MG上,采用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)检测Panx-1-siRNA转染后U87-MG细胞增殖能力的改变。结果第一部分实验结果：1.U87-MG上可见Panx-1蛋白表达,阳性颗粒多见于细胞浆内,并高表达于核分裂象细胞。2.与无效序列转染组比较,Panx-1-siRNA转染后,Panx-1在mRNA及蛋白水平表达均下降(P<0.05)。同时,细胞外液中IL-6、IL-8及谷氨酸浓度降低,有统计学意义(P<0.05)；另外细胞外液中IL-1β浓度亦降低,但未发现有统计学差异(P>0.05)。3. LPS及ATP处理U87-MG后Panx-1蛋白表达无明显变化,同时细胞外液中IL-1β、IL-6、IL-8及谷氨酸浓度亦无明显改变(P>0.05)。第二部分实验结果：与无效序列转染组比较,Panx-1蛋白表达下调后,反映细胞增殖能力的标志物增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)蛋白水平同步降低,同时Panx-1-siRNA转染后U87-MG增殖能力显著下降(P<0.01)。结论1. Panx-1表达下调后,U87-MG细胞外液中IL-6、IL-8及谷氨酸浓度降低,提示Panx-1参与了U87-MG对细胞因子IL-6>、IL-8及兴奋性氨基酸谷氨酸的释放。2. Panx-1表达下调后,U87-MG增殖能力下降,提示Panx-1参与了U87-MG的增殖。