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背景与目的:乙型肝炎病毒(HBV)对人体危害严重并可以通过血液传播,所以针对献血者的血液筛查非常严格。在使用酶联免疫法检测HBs Ag后,又进行了核酸检测(NAT),其高灵敏度的检测能力大大降低HBV输血传播的风险。在对HBs Ag阴性血液进行Ultrio NAT单检时发现有一部分出现HBV、HCV、HIV-1联检反应性但病毒鉴别实验为无反应性的结果,即所谓的重复无反应性(NRR)。尽管对血液采取了报废措施、献血者也进行了屏蔽,不会造成经血传播病毒的风险,但依照常规流程无法对血液检测结果进行确认。本研究的主要目的是利用PEG8000对血浆中的病毒进行富集,采用高灵敏度的实时荧光定量PCR和巢式PCR对NAT重复无反应性结果进行确认。方法:1.试验室实时荧光定量PCR和巢式PCR试验体系的确立。WHO HBV标准品采用磁珠法提取HBV DNA后按比例稀释,确定本实验室的HBV实时荧光定量PCR检测体系的最小检出限。对临床阳性样本S1进行定量,以此替代WHO标准品确定本实验室自有的HBV Pre S/S巢式PCR和HBV S巢式PCR的最小检出限。2.PEG富集血浆HBV病毒方法的建立及富集效率的验证。采用阴性血浆对阳性样本S1按比例稀释,等体积加入PEG8000(6ml)后离心沉降,磁珠法提取HBV DNA,采用自有的实时荧光定量PCR进行定量,计算富集效率。富集效率=实际测量值/理论值*100%。对15个NRR和5个OBI样本进行PEG8000富集病毒后巢式PCR检测HBV Pre S/S、S区段与Elite体系12次重复检测(出现1次及以上反应性即为检出)、超高速离心富集病毒巢式PCR检测HBV Pre S/S、S区段结果比较。3.对Ultrio NRR样本进行电化学发光A-HBc、HBs Ag检测;进行实时荧光定量PCR的检测;进行巢式PCR HBV Pre S/S、S区段的检测;进行Ultrio试剂2遍联检和1遍鉴别检测,计算并比较不同方法对Ultrio NRR样本的阳性检出率。结果:1.自有实时荧光定量PCR HBV检测95%检出限为10IU/m L。阳性样本S1病毒浓度为5×105 IU/m L。当病毒载量达到2.5 IU/m L时,用巢式PCR检测HBV S区段可以稳定检出;当病毒载量达到5 IU/m L时,用巢式PCR检测HBV Pre S/S区段可以稳定检出。2.PEG8000富集HBV病毒的效率为46.3%,95%置信区间为33.7%-58.8%。Elite体系可检出全部5个OBI样本,15个Ultrio Plus NRR样本检出6个,总检出率为55%。PEG8000富集病毒(6m L)方法利用实时荧光定量PCR和巢式PCR对Pre S/S、S区段的检测,对于5个OBI也全部检出,15个Ultrio Plus NRR样本也检出6个,总检出率为55%。PEG8000富集病毒方法可以达到多次重复试验的检出水平。超高速离心富集病毒的方法(12 m L)利用巢式PCR对样本Pre S/S、S区段进行检测,5个OBI样本检出4个,15个Ultrio Plus NRR样本检出5个,总检出率为45%。通过PEG8000富集病毒(6m L)方法利用巢式PCR对Pre S/S、S区段的检测,对于5个OBI也全部检出,15个Ultrio Plus NRR样本也检出5个,总检出率为50%。PEG8000富集病毒方法可以达到超高速离心富集病毒方法的检出水平。3.在123个Ultrio NRR样本中,不同方法总共确认阳性数为31个,占试验样本的25.2%,其中A-HBc阳性的样本为25/31个,占80.6%。PEG病毒富集方法确认的阳性数(HBV检出率)高于Ultrio体系的重复检测,经X2检验差异具有显著性(P<0.01)。Ultrio NRR确认阳性献血者中首次献血者占比为54.8%,重复献血者为45.2%。Ultrio NRR样本利用PEG病毒富集后病毒定量,共有24个样本阳性,其中病毒载量<10IU/m L的样本15个,占62.5%;病毒载量≥10、<20 IU/m L的样本5个,占20.8%;病毒载量≥30、<100 IU/m L的样本4个,占16.7%。结论:1.建立了PEG8000富集病毒HBV检测方法,提高了HBV检出率,有助于Ultrio NRR样本的确认。2.Ultrio NRR血液存在一定的HBV残留风险。3.PEG病毒富集方法HBV检出率显著高于Ultrio体系检测HBV。4.重复献血者在Ultrio NRR确认阳性的献血者中占有很高比率。5.Ultrio NRR确认阳性血液HBV病毒载量很低。