近年来,纳米材料与技术及分子组装在电化学传感领域的广泛应用为发展各类生物传感器提供了强有力的工具和新的发展机遇。同时,随着生物电分析化学的快速发展,具有生物活性的分子也被引到该传感界面,在纳米尺度的生物分子识别和协同引起了国内外同行的高度关注。因此,在电极界面上构建选择性好和灵敏度高的纳米结构以提升电化学生物传感器的性能,已成为生物化学及生物医学工程研究的热点。本论文着眼于电极界面上新型纳米结构的组装,以提高传感界面上目标分子的捕获效率,实现信号放大和靶标分子的可控识别。由此,我们在电极界面上构建了一系列功能化纳米结构,完成了一些静态和动态纳米结构的组装,从而在整体上提升了电化学生物传感器的性能,实现了对小分子、蛋白质、核酸、细胞等生物靶标更加有效的分析检测。具体内容如下:1.电极界面双巯基“茎环”DNA纳米结构的组装用于超灵敏核酸检测基于双巯基“茎环”DNA纳米结构的构建,我们提升了传感界面对靶标的捕获能力,促进了电化学核酸传感器的实际应用。我们发现,固定在电极表面上的双巯基“茎环”DNA纳米结构,不仅可以有效地与目标或信号探针结合,同时也能有效阻止蛋白的非特异吸附,因而不仅能够实现埃摩尔的核酸分子(在100μL样品中约300个分子)的检测,并且能区分单碱基差异。同时,DNA纳米结构在电极表面的组装变得更加简单(一步法)、快速(30min)和均质(单个探针形成的纳米结构)。这些优点归因于我们独特的“茎环”DNA结构设计,其中“茎”作为刚性支架以保持在电极表面上的直立,“环”提供了靶标和信号探针的结合位点。更重要的是,通过调节酶和电极表面间的距离(从8.3至13.6 nm),我们可以有效地控制传感器的性能。此外,结合该DNA纳米结构的高捕获效率,由此构建的传感界面可以在复杂体系中实现核酸分子的检测,包括PCR产物、mRNA和microRNA等,为今后生物医学研究及临床应用打下了很好的基础。2.电极界面构建蛋白质—适体“手拉手”纳米线结构用于肿瘤相关蛋白的检测基于蛋白质—适体纳米线自组装结构,我们建立了 一种分析肿瘤相关蛋白(人血小板衍生因子,PDGF)的电化学传感策略。本工作中,我们利用人血小板衍生因子拥有两个DNA适体结合位点的性质,在靶蛋白结合适体并诱导其发生构象变化形成完整的“茎环”结构后,不同靶蛋白上结合的DNA适体可以通过末端延伸出的短链相互杂交,最终形成蛋白质—适体线状纳米结构,使被修饰在电极表面的捕捉链将靶标单白捕获且固定到电极表面。同时,由于适体的磷酸骨架上带有很多的负电荷,因此可以通过静电吸附作用将溶液中大量带正电荷的电信号分子六氨合钌([Ru(NH3)6]3+)富集到电极表面,产生信号放大的效果。实验表明,该方法可以检测到低至100 fM的人血小板衍生因子,并且具有良好的选择性。3.电极表面DNA“步行者”纳米结构的组装及其在疾病标志蛋白检测中的应用基于我们所设计的DNA“步行者”动态纳米自组装结构,我们建立了一种用来分析多种疾病标志蛋白电化学传感策略。在这一工作中,我们以靶标蛋白分子为主体,以含有DNA核酶(DNAzyme)序列和靶蛋白识别元件的双功能DNA探针为运动结构,组装成可以在电极界面“行走”的DNA“步行者”组装体。在无靶标蛋白存在情况下,双功能DNA探针与电极上很短的DNAzyme底物链无法形成有效的互补配对,因而DNAzyme不会切割金电极上的底物链,底物链上标记的电信号分子可以产生很好的电信号。然而,在靶标蛋白存在的情况下,由于一个靶蛋白分子可以结合数个双功能DNA探针形成DNA“步行者”,因此可以通过多个双功能DNA探针在邻位效应的作用下,与电极上的底物链发生杂交并将之切割,而热稳定性的变化促使双功能DNA探针从被切割的底物链上脱离下来,继续搜寻结合附近完整的底物链并将其切割,最终形成有效的放大效应,达到超灵敏检测目标蛋白的目的。研究结果表明,我们提出的电化学方法可以检测到fg/mL级别的人重组血小板衍生因子,血管内皮生长因子,前列腺特异抗原,癌胚抗原,α-甲胎蛋白和肌钙蛋白,并且具有良好的选择性。进一步研究表明,使用这一新方法在心血管病人的血清中检测肌钙蛋白,相较于传统的ELISA技术拥有更好的检出率。4.电极表面双链DNA纳米结构的形成用于MTH1酶活性分析基于碱基错配(“8-oxoG:A”错配)的DNA链延伸反应(MB-DCE)体系,我们建立了一种分析MutT同源酶1(MTH1)活性的电化学分析策略。这一工作中,我们通过基于错配的DNA链延伸策略,我们在电极界面上构建了酶活性控制的DNA链杂交反应,用以控制电极表面双链DNA纳米结构的形成,从而实现对MTH1活性的分析。具体而言,我们设计了包含多个腺嘌呤的模板T-DNA,并且在该模板末端修饰有电化学信号分子,亚甲基蓝(MB),作为信号输出元件,在没有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的DNA延伸体系中,8-oxo-dGTP可与T-DNA上的腺嘌呤发生错配,替代dTTP插入到DNA链中,此时双链DNA不能与修饰在电极表面的捕获DNA(C-DNA)进行互补配对,从而实现对MB信号分子的屏蔽。但是,当存在MTH1的情况下,8-oxo-dGTP被水解,引物链就不能以T-DNA为模板进行延伸,此时T-DNA就可与电极上的C-DNA杂交,在电极上形成双链DNA纳米结构,完成电化学信号的输出。由此,我们实现了酶活性控制的DNA链杂交,并以此建立起电化学信号与MTH1活性大小的关联。我们还将该方法直接用于细胞中MTH1活性的分析,并且测定了不同的乳腺癌细胞中MTH1的活性,取得了理想的实验结果。-5.电极表面构建氧化还原驱动的主客体分子识别体系用于细胞分析基于在电极界面上构建氧化还原响应的主客体分子识别体系,我们实现了电化学控制的细胞结合与释放。在这一工作中,主客体分子(β环糊精/二茂铁)的识别受到电化学刺激的控制,施加还原电位时,不带电荷的客体分子(Fc)可以与修饰在电极表面的主体分子(β-CD)结合,实现细胞的捕捉;相反,当施加氧化电位时,Fc被氧化成Fc+,主客体识别被解离,细胞得以释放。这种电位控制的细胞可控结合与释放过程对细胞是无损的。更为重要的是,Fc可以直接作为电化学信号分子实现信号同步输出,可对捕获的细胞进行分析和定量研究。另外,大量的信号分子被负载到细胞上,可以实现电化学信号的放大,由此我们实现了对细胞的高灵敏度分析,可以分析最少10个细胞。因此,这个电化学体系有望被进一步用于循环肿瘤细胞(CTCs)的分离和检测,也有望在其它细胞分析中发挥重要作用。