研究内容:据世界卫生组织报道,2018年全世界有960万人死于癌症,而肺癌无论是发病率还是死亡率均居各种癌症之首(全世界每年有170万人死于肺癌)。目前,肺癌治疗以手术、放疗、化疗和靶向治疗等综合治疗为主。化疗和放疗在晚期肺癌的治疗中发挥着重要的作用。肺癌是常见的实体肿瘤,可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌的发病率约占肺癌的80%。非小细胞肺癌以腺癌和鳞癌为主。近年来,由于靶向药物的应用,肺腺癌患者的生存期得到大幅度提高。相比之下,肺鳞癌患者的生存期却没有突破性进展。因此,迫切需要新的治疗方法来提高肺癌患者的生存率以及延长肺癌患者的生存期。细胞微环境中包括炎症因子在内的细胞因子影响肿瘤细胞的增殖和存活。在众多的炎症因子中,被人们广泛研究的主要包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-8(IL-8)以及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)等。已经有文献证实炎性因子通过TOLL样受体(TLR)介导的ERK,NF-κB,STAT-3等信号通路的激活在许多肿瘤,如肝癌,胃癌,胆囊癌,间皮瘤,前列腺癌和结肠癌等的发生和发展过程中起促进作用。众所周知,应激、损伤或死亡的细胞会释放损伤相关模式分子(DAMPs),引发非传染性炎症应答反应。其中,HMGB1是DAMPs的一种,通过其受体RAGE促进肿瘤细胞的存活。HMGB1通过组织DNA并调控转录,在细胞内外具有多种生物学功能,尤其是促进炎症和肿瘤的发生。由于HMGB1在某些慢性疾病中水平的升高,与其受体RAGE结合后在大多数与炎症甚至某些肿瘤相关的疾病中具有较好的效果。此外,由Rel家族成员组成的NFκB蛋白,对应激,免疫和炎症反应都起着重要的作用。如今,人们也已经发现,NFκB家族成员通过程序性细胞死亡,肿瘤的发生以及增殖,转移等与肿瘤进展有着密切的关系。同样地,近年来发现,STAT家族蛋白,尤其是STAT3,在致癌炎性微环境中发挥着重要作用。这不仅发生在恶性转化的初期,而且发生在肿瘤的进展过程中。研究表明,许多人类恶性肿瘤,包括淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤等,都与STAT3有关。因此,通过抑制STAT3信号通路治疗癌症也将会是一种可行的方法。丙酮酸乙酯(EP)是从内源性代谢产物丙酮酸中提取的一种稳定的亲脂酯,是一种极其重要的有机合成中间体。在自然状态下是一种无色透明的液体。EP具有许多药理作用,如减轻氧化还原引起的细胞和组织损伤,抗炎,促进凋亡过程等。EP抑制HMGB1的释放。我们课题组为了研究炎性因子HMGB1在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)增殖中的作用,做了两部分研究:首先用人重组HMGB1蛋白、HMGB1抑制剂EP或两者联合使用处理DLBCL细胞,检测GCB和ABC-DLBCL细胞增殖能力的变化,并在体内水平验证细胞外HMGB1在淋巴瘤增殖能力中发挥的作用。随后,又用EP处理细胞,检测培养基和细胞内以及小鼠血浆和肿瘤组织中HMGB1的水平,验证EP是否能抑制HMGB1的表达和释放;基于以上研究结果,又进一步在体内外水平探究了HMGB1影响淋巴瘤增殖能力的具体机制。流式细胞学分析结果表明,低剂量EP并不增加细胞的凋亡,但显著地引起了G1期的阻滞。低剂量EP抑制HMGB1后,细胞周期相关蛋白P27的水平上调,P27与Cyclin A/CDK2的结合能力提高,Src、ERK的磷酸化水平下降。当用Src抑制剂Dasatinib处理细胞后,同样得到类似上面的结果,这说明HMGB1引起的细胞周期进展是Src依赖的。基于课题组对EP对弥漫大B细胞淋巴瘤研究的经验,以及EP在不同程度上抑制多种类型肿瘤的研究的基础,以及靶向药物对鳞癌腺癌巨大差距的疗效,我们研究了EP对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用,并试图阐明其可能的机制。研究目的:1.探究EP对非小细胞肺癌的生长影响以及EP对非小细胞肺癌凋亡的影响。2.探究EP对非小细胞肺癌侵袭迁移的影响。3.探究EP抑制非小细胞肺癌的生长,侵袭迁移,以及促进其凋亡是通过HMGB1-RAGE轴和STAT3/NFκB通路。研究方法:1.用不同浓度的EP分别处理A549(腺癌,来自天津市肿瘤医院肺癌研究中心),H520(鳞癌,来自天津市肿瘤医院肺癌研究中心),PC-9(腺癌,来自天津市肿瘤医院肺癌研究中心)三种非小细胞肺癌细胞,MTT法和克隆形成实验探究EP对非小细胞肺癌生长的影响。2.用不同浓度的EP分别处理A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后流式测细胞凋亡,细胞的凋亡率通过Annexin-V异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)检测。3.用不同浓度的EP分别处理A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞,细胞划痕实验和TANSWELL实验探究EP对非小细胞肺癌侵袭迁移能力的影响。4.用不同浓度的EP分别处理A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后收取集细胞,提取蛋白和RNA,WESTERN BLOT和RT-PCR检测PCNA,MMP-9,P53,HMGB1,RAGE在蛋白水平和RNA水平的表达。5.用不同浓度的EP分别处理A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后收取集细胞并提取蛋白,WESTERN BLOT检测BCL-2家族相关蛋白,BAX,BCL-2,MCL-1在不同浓度EP处理后的蛋白表达。6.用30mmol/l的EP处理A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞,在0,2,4,6,8H收集细胞,WESTERN BLOT检测相应时间点的STAT3,NFκB,P-STAT3,P-NFκB(P65)的表达。研究结果:1.丙酮酸乙酯EP按照0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度递增作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞,细胞活力和细胞数量随着浓度梯度的递增而递减。克隆形成实验很好的验证了这一结果。同时,丙酮酸乙酯EP按照0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度递增作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后收集并提取的蛋白和RNA,核增殖抗原PCNA在蛋白水平和在RNA水平的表达随浓度增加而降低。2.丙酮酸乙酯EP按照0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度递增作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后进行PI和FITC双染测凋亡实验,结果发现:随着EP浓度的增加,A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞凋亡率呈递增趋势。丙酮酸乙酯EP按照0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度递增作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后收集并提取蛋白和RNA,P53在蛋白水平和在RNA水平表达随浓度增加而增加。3.20 mmol/l的丙酮酸乙酯EP作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后,进行的划痕实验和TRANSWELL实验发现,和对照组相比,经20 mmol/l的EP处理过的A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌的侵袭迁移能力显著降低。丙酮酸乙酯EP按照0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度递增作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后收集提取蛋白和RNA,MMP-9在蛋白水平和在RNA水平表达随浓度增加而降低。4.丙酮酸乙酯EP按照0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度递增作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后收集并提取蛋白和RNA,随着EP浓度的增加,A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌的HMGB1和RAGE分子在蛋白水平和RNA水平表达随浓度的增加降低。5.丙酮酸乙酯EP按照0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度递增作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后收集并提取蛋白,随着EP浓度增加,A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌的BCL-2家族蛋白表达水平的变化为:促凋亡蛋白BAX随着浓度的增加而增加,抑制凋亡的蛋白BCL-2和MCL-1蛋白呈现递减变化。6.30mmol/l的丙酮酸乙酯EP处理A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞0,2,4,6,8H后收集并提取蛋白,P-STAT3,P-NFκB(P65)呈明显下降趋势。研究结论:1.当以0,5,10,20,30 mmol/l的浓度梯度作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后发现:丙酮酸乙酯EP抑制非小细胞肺癌细胞的生长,促进非小细胞肺癌的凋亡,随着EP浓度的增加,EP对非小细胞肺癌的生长的抑制作用递增,促凋亡率递增。2.20 mmol/l的丙酮酸乙酯EP作用于A549,H520,PC-9三种非小细胞肺癌细胞后发现:EP显著的抑制非小细胞肺癌的侵袭迁移能力。3.EP抑制非小细胞肺癌的生长增殖,侵袭迁移的能力以及促进其凋亡能力通过HMGB1-RAGE轴以及通路STAT3/NFκB。