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高原是一种特殊的自然环境,其典型特点是低压、低氧。多年生活在高海拔地区缺氧环境下,容易引起红细胞过度增多和低氧血症,其严重影响着高原人群的健康。由于机体长期在高海拔、低氧状态下,红细胞过度积累,引起血液黏滞度增加,血流减慢,机体发生微血管增生以改善血液循环,以代偿供氧,其发生机制尚未阐明。在肿瘤性疾病局部缺氧条件下,IL-6/JAK2/STAT3参与调控其微血管生成以促进肿瘤的转移及进展。机体在低氧条件下,IL-6分泌增加,进而加强调控下游靶基因JAK2/STAT3的P-JAK2、P-STAT3的表达,从而激活其靶基因MMP-9的表达。在一系列缺血缺氧性疾病中,MMP-9的高表达促进其微血管的再生及基膜降解。然而,JAK2/STAT3通路和MMP-9是微血管生成及基膜降解过程中极为重要的因子,有关JAK2/STAT3和MMP-9在肿瘤微血管生成中的变化得到广泛的研究。然而,在长期低氧下,IL-6/JAK2/STAT3/MMP-9通路在骨髓中变化如何,是否参与微血管增生及基膜降解,目前还不清楚。血管基膜是一种复杂的致密网状结构,其组成成分包括:层黏连蛋白,IV型胶原蛋白及纤维连接蛋白等。MMP-9主要的生物学功能是降解IV型胶原纤维。在低氧条件下,MMP-9的高表达,会导致机体血管基膜发生降解。其中,COL4A1作为极为重要的IV型胶原纤维,与MMP-9在基膜降解过程中的变化如何,目前还不清楚。第一部分慢性低氧下,大鼠骨髓微血管变化与IL-6/JAK2/STAT3/MMP-9通路的相关研究目的骨髓系成人造血的主要部位,骨髓微血管是其微环境的主要结构基础。JA K2/STAT3和MMP-9参与促进微血管生成的病理生理过程,然而JAK2/STAT3对MMP-9的调控作用还需要进一步验证,目前还尚未见到IL-6/JAK2/STAT3/M MP-9通路是否调控低氧引起的微血管增生及基膜降解的研究。本研究通过测定外周血中RBC、HB、HCT,血清中IL-6的水平以及骨髓中P-JAK2蛋白、P-ST AT3蛋白及MMP-9 m RNA和蛋白水平,同时检测微血管密度及基膜降解情况,并与对照组进行比较分析,在应用STAT3抑制剂后,进一步测定以上指标,进一步验证,寻找它们之间的关系。试图探讨IL-6/JAK2/STAT3/MMP-9通路在骨髓微血管增生及基膜降解的机制中的作用。方法建立大鼠动物模型,以雄性SD大鼠分为对照组(Control)、低氧组(CH group)、低氧加抑制剂组(CH+Inhibitor group,抑制剂SH-4-54采用灌胃给药30天,7.5 mg/kg/d)[29]、低氧加溶剂对照组(CH+Solvent group,溶剂为0.9%生理盐水+1.3%的DMSO),每组各30例为研究对象,其中低氧模型制备均在高原医学研究中心低压氧舱内进行,模拟海拔5000 m,24h/d,连续30d。30 d后,检测大鼠血常规。Elisa法测定各组大鼠血清中IL-6的水平,采用实时荧光定量RT-PCR法检测各组大鼠骨髓中MMP-9 m RNA的表达水平,运用Western blot法分析各组大鼠骨髓中MMP-9蛋白含量,运用免疫共聚焦显微镜观察各组大鼠骨髓中MMP-9的表达及微血管增生及基膜降解情况,即用免疫荧光MMP-9标记血管内皮细胞后,通过共聚焦显微镜观察各组组织中MMP-9阳性微血管密度计数以及通过电子显微镜观察血管基底膜的降解情况,运用STAT3抑制剂SH-4-54阻断该通路后再次检测以上指标进行功能验证,进行组间检测指标的对比分析。结果(1)在经过低氧30天处理组中,大鼠血常规(RBC、HB、HCT)指标均高于常氧对照组(P<0.050);(2)在低氧组、低氧加抑制剂组、低氧加溶剂对照组中,大鼠骨髓微血管密度(MVD)均高于常氧对照组,且血管基膜发生明显降解(P<0.05)。(3)与常氧对照组相比,在低氧组、低氧加抑制剂组、低氧加溶剂对照组中,大鼠血清中IL-6水平明显高于常氧对照组(P<0.05),骨髓中P-JAK2、P-STAT3及MMP-9的蛋白含量均高于常氧对照组(P<0.05),MMP-9的m RNA水平明显增高(P<0.05)。(4)在低氧组、低氧加抑制剂组、低氧加溶剂对照组中,大鼠骨髓微血管密度(MVD)及基膜降解情况与该组MMP-9蛋白和m RNA的表达水平一致。(5)应用STAT3抑制剂后,在低氧加抑制剂组,与低氧组比较,大鼠骨髓的P-STAT3蛋白及MMP-9蛋白和m RNA的表达水平明显降低(P<0.05)。(6)在低氧加抑制剂组中,与低氧组相比,大鼠骨髓微血管密度(MVD)减少及基膜降解减轻(P<0.05)。(7)在低氧加抑制剂组,大鼠骨髓的P-JAK2蛋白含量明显低于低氧组(P<0.05)。(8)在低氧加抑制剂组,大鼠血清中IL-6水平及血常规(RBC、HB、HCT)指标均低于低氧组(P<0.05)。(9)与低氧加溶剂对照组相比,低氧组中大鼠骨髓中P-JAK2、P-STAT3及MMP-9的蛋白含量及MMP-9 m RNA的表达水平没有明显差异(P>0.05)。(10)与低氧加溶剂对照组相比,低氧组中大鼠血清中IL-6的含量和血常规(RBC、HB、HCT)指标没有明显差异(P>0.05)。结论1.慢性低氧下,大鼠骨髓微血管增生及基膜降解,此外,骨髓中IL-6、P-JAK2、P-STAT3及MMP-9表达升高。2.应用STAT3抑制剂后,P-STAT3和MMP-9表达降低。3.慢性低氧下,大鼠骨髓微血管生成及基膜降解与IL-6/JAK2/STAT3/MMP-9通路有关。第二部分不同时间低氧暴露下大鼠骨髓血管基膜变化与MMP-9和COL4A1相关研究目的缺氧会造成机体多系统多脏器损伤,其中不同程度的血管基膜损伤尤为常见。基膜的重要组成部分包括IV型胶原纤维,其中COL4A1是重要成员之一。MMP-9在低氧条件下表达增高,其发挥主要生物学功能,降解IV型胶原纤维。我们前期研究发现,低氧损伤血管基膜,其机制目前尚不清楚。本研究通过建立不同时间的低氧动物模型,了解大鼠骨髓中MMP-9在不同低氧条件下的表达及对血管基膜中COL4A1在骨髓中的影响及变化。方法建立大鼠动物模型,以雄性SD大鼠分为对照组(Control group)、低氧3-d组(3 days group)、低氧7-d组(7 days group)、低氧10-d组(10 days group),每组各20例为研究对象,其中低氧模型制备均在高原医学研究中心低压氧舱内进行,模拟海拔7000m,24h/d,分别饲养3d、7d、10d后检测大鼠血常规。采用实时荧光定量RT-PCR法检测各组大鼠骨髓中MMP-9 m RNA的表达水平,运用Western blot法分析各组大鼠骨髓中MMP-9及COL4A1的蛋白含量,运用免疫组化特异性染色观察各组大鼠骨髓中COL4A1的表达,运用电子显微镜观察大鼠在不同时间急性缺氧条件下血管基膜的降解情况。结果(1)大鼠血常规(RBC、HB、HCT)指标表达水平随着缺氧时间延长,逐渐增高;低氧10天组血常规各指标高于低氧7天组(P<0.05);低氧7天组血常规各指标高于低氧3天组(P<0.05);低氧10天、低氧7天和低氧3天组血常规各指标均高于各自常氧对照组(P<0.05)。(2)低氧条件下,大鼠骨髓MMP-9 m RNA及蛋白表达水平,低氧10天组明显高于低氧7天组(P<0.05);低氧7天组高于低氧3天组(P<0.05);低氧10天、低氧7天和低氧3天组MMP-9表达均高于常氧对照组(P<0.05)。(3)大鼠骨髓中COL4A1蛋白含量随着低氧时间延长逐渐下降;低氧10天组明显低于低氧7天组(P<0.05);低氧7天组低于低氧3天组(P<0.05);低氧10天、低氧7天和低氧3天组均低于常氧对照组(P<0.05)。(4)大鼠骨髓中血管基膜降解情况随着低氧时间延长逐渐加重,低氧10天基膜降解重于低氧7天组(P<0.05);低氧7天基膜降解重于低氧3天组(P<0.05);低氧10天、低氧7天和低氧3天均发生基膜降解与常氧对照组相比(P<0.05)。(5)低氧条件下,大鼠骨髓中COL4A1的表达与基膜降解的严重程度一致MMP-9的水平增高与COL4A1的表达下降一致。结论1.低氧条件下,大鼠骨髓微血管基膜发生降解。2.不同时间低氧下,大鼠骨髓中MMP-9表达增多,COL4A1表达下降。3.在低氧条件下,大鼠骨髓血管基膜降解与MMP-9及COL4A1有关。