论文部分内容阅读
背景与目的:在世界范围内,每年肝癌患者死亡率为70万。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌最主要的病理类型,占90%上,具有侵袭性高、转移及复发率高等特点。乙型肝炎和丙型肝炎,酒精和黄曲霉毒素被认为是肝癌的主要危险因素。尽管,在HCC治疗中外科技术、化疗和放疗的应用不断发展,但患者5年生存率仍仅占7%,主要是由于肿瘤复发和转移。由此,有效和耐受性良好的晚期HCC新治疗方法十分必要。索拉菲尼（Sorafenib）和瑞戈非尼（Regorafenib）是目前仅有的靶向治疗药物。然而索拉菲尼仅能有效延长患者生存期2.8个月,且治疗后很快产生耐药性;瑞戈非尼也仅能有效提高患者生存期10.6个月。因此,迫切需要开发新的靶点明确的药物。组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases,HDACs）可从核心组蛋白特定赖氨酸残基中除去乙酰基,通过染色质结构修饰调节基因转录。HDACs通常与其他转录共抑制因子（如mSin3,SMRT和N-Co R）形成复合物,参与各种生理过程,如细胞周期进展、分化、凋亡与肿瘤发生。由于肿瘤组织中组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases,HDACs）活性异常,多个HDAC抑制剂（HDAC inhibitors,HDACi）已由美国食品药物管理局（FDA）用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）或外周T细胞淋巴瘤（PTCL）。而,HDACi在肝癌中的疗效仍不得而知。HDAC包含四个家族18个成员,各成员功能尚未完全阐明。某些HDAC成员发现是与特定的疾病有关,如癌症和神经退行性疾病。早期的HDACi为广谱抑制剂,如SAHA,TSA,VPA和丁酸。其在癌症治疗中的作用和副作用不可预测。选择性HDACi可望开发为具备更精确治疗效果和副作用少的药物。HDAC1和HDAC2为I类HDAC家族成员,在器官和组织中广泛表达,包括肝脏。有研究表明,95%以上肝癌患者的肝中HDAC1/2为高水平。且,HDAC1/2高表达的肝癌患者5年生存率为40%,而低表达的高达81.8%。结合HDAC1和2的结构相似性和功能互补性的特点,我们推测:HDAC1/2联合抑制有较好的肝癌治疗效果。为验证这一假设,我们使用2个不同的选择HDACis治疗肝癌细胞株,分别是HepG2和Huh7,以及1种正常的肝细胞株L02,检测其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。我们发现选择性抑制HDAC1或2不影响肝癌细胞的生长,但联合抑制HDAC1和2可促进p19INK4d和p21WAF1/CIP1转录增加,导致细胞周期阻滞和促进凋亡。方法:1.HDAC1/2在肝癌中表达改变收集临床样本,提取组织蛋白,WesternBlot检测HDAC1/2的表达水平;培养常见的人肝癌细胞Huh7、Hep G2、Hep3B、PLC/PRF/5,SK-Hep1、MHCC97H、MHCC97L,以及正常肝细胞株L02,应用Western Blot方法检测HDAC1/2蛋白表达。利用TCGA数据库收集肝癌患者的基因组数据,分析肝癌组织中HDAC1/2的表达情况。2.特异性抑制HDAC1/2对细胞周期的影响选择HDAC1抑制剂CI994（Tacedinaline）,HDAC2抑制剂Santacruzamate A（CAY10683）,HDAC1/2联合抑制剂Romidepsin（FK228）和广谱抑制剂Vorinostat（SAHA）处理人肝癌细胞,流式分析仪检测细胞周期分布和凋亡情况,WesternBlot和荧光定量PCR监测CDKs和CDKNs蛋白水平变化。通过si RNA抑制人肝癌细胞的HDAC1/2表达,流式分析仪检测细胞周期分布和凋亡情况,WesternBlot和荧光定量PCR监测CDKs和CDKNs蛋白水平变化,进一步验证抑制剂的作用。同时构建裸鼠皮下肝癌成瘤模型,使用抑制剂瘤体内注射,验证特异性抑HDAC1/2对肝癌细胞的周期阻滞作用。3.特异性抑制HDAC1/2对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的影响Western Blot和荧光定量PCR监测HDAC1/2抑制后,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子水平。设计p19INK4d和p21WAF1/CIP1启动子区的PCR引物,通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）验证HDAC抑制剂作用的机制。结果:1.HDAC1/2在肝癌中表达改变Western Blot检测收集到的12对肝癌临床样本中有7对HDAC1在肝癌组织中表达上调,有9对HDAC2表达上调。培养常见的人肝癌细胞Huh7、HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5,SK-Hep1、MHCC97H、MHCC97L,以及正常肝细胞株L02。Western Blot方法检测HDAC1在Huh7、Hep G2、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L细胞中表达较L02细胞增加。HDAC2在Huh7、HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5细胞中表达较L02细胞增加。使用TCGA下载的373例独立的HCC患者的基因组数据（包含50对癌和癌旁组织）,结果显示,肝癌患者中HDAC1/2均较癌旁组织升高,同时高HDAC1/2表达预测肝癌患者的生存期明显缩短。2.特异性抑制HDAC1/2对细胞周期的影响HDAC1/2联合抑制后显微镜下可见,肝癌细胞形态变化。结晶紫染色显示,肝癌细胞生长抑制。流式分析仪检测细胞凋亡和细胞周期阻滞。构建裸鼠皮下肝癌模型,瘤体内注射HDAC抑制剂后,测量瘤体体积和重量显示,联合抑制HDAC1/2可显著减少瘤体的重量和体积。3.特异性抑制HDAC1/2对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的影响为进一步阐释机制,设计p19INK4d和p21WAF1/CIP1的启动子区引物,ChIP验证,两种CDKI的启动子区H3K18、H3K56和H4K12的乙酰化水平均增加。siRNA抑制HDAC1/2表达,亦可上调p19INK4d和p21WAF1/CIP1表达,阻滞人肝癌细胞周期和诱导细胞凋亡。结论:1.HDAC1/2在肝癌中表达显著上调。2.HDAC1/2联合抑制剂可促进p19INK4d和p21WAF1/CIP1转录,可有效阻断人肝癌细胞周期抑制细胞增殖。由此,HDAC1/2特异性抑制可为一个潜在的肝癌治疗靶点。