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目的:探讨缺锌环境下miR-193b影响食管癌放射敏感性的机制,从而为提高食管癌患者放疗效果提供思路。方法:1.研究对象:1.1人食管癌细胞KYSE1501.2在河北医科大学第四医院接受放化疗的75例食管癌患者的血清。2.实验方法:2.1构建具有放疗抗性的食管癌细胞系以及应用克隆形成实验、流式细胞术、CCK8、qRT-PCR和Western blot检测食管癌细胞的放射敏感性、细胞凋亡、细胞周期和Cyclin D1表达水平。2.2应用克隆形成实验、流式细胞术、qRT-PCR和Western blot检测缺锌环境对食管癌细胞放射敏感性、细胞周期、细胞凋亡和Cyclin D1表达水平的影响。2.3应用数据库筛选与Cyclin D1可能相关的miRNAs,应用免疫荧光素酶实验验证miR-193b与Cyclin D1之间的关系。应用qRT-PCR检测缺锌环境下食管癌细胞中miR-193b的表达水平。应用MSP检测miR-193b启动子区域上Cp G岛的甲基化状态。应用Epi Seeker DNMT（DNA甲基转移酶）活性定量分析检测缺锌对食管癌细胞中DNMT活性的影响。2.4应用克隆形成试验、流式细胞术、qRT-PCR和Western blot检测上调miR-193b对缺锌环境下食管癌细胞的放射敏感性、细胞周期、Cyclin D1表达水平的影响。2.5应用χ2检验或Fisher确切概率法分析血清中miR-193b的表达与锌缺乏地区75例食管癌患者临床特征的关系。应用ROC曲线分析血清中miR-193b区分食管癌患者的疾病控制率（DCR）的预测效率。总体生存期采用Kaplan-Meier曲线描述。3.统计学方法:使用SPSS 21.0和Excel进行统计分析,采用t检验分析计量资料,使用χ2检验或Fisher精确概率法分析计量资料,利用ROC曲线评估血清中miR-193b表达水平区分患者的DCR的能力。总体生存期采用Kaplan-Meier曲线描述,使用log-rank检验比较不同组患者的生存率。结果:1.构建具有放疗抗性的食管癌细胞系以及检测食管癌细胞的细胞凋亡、细胞周期和Cyclin D1表达水平1.1通过分析克隆形成实验发现:在未用放射线照射时,KYSE150细胞的克隆形成细胞团数量与KYSE150R细胞相比,差异无统计学意义（P>0.05）。在辐射剂量为3、6、9Gy时,KYSE150细胞的克隆形成细胞团数量与KYSE150R细胞相比,差异具有统计学意义（3Gy:45±9.54 VS72.33±4.51;6Gy:15±3.61 VS 54.67±3.06;9Gy:6.33±2.08 VS 35.33±5.86,P<0.05）。1.2通过分析流式细胞术结果发现:在KYSE150细胞中,在G0/G1期的比例高于KYSE150R细胞（50%VS 68%,P<0.05）,在G2/M期的比例低于KYSE150R细胞（17%VS 4%,P<0.05）。1.3通过分析CCK 8实验结果发现:KYSE150细胞的OD值与KYSE150R细胞相比,差异没有统计学意义（P>0.05）。1.4通过分析qRT-PCR实验结果发现:与KYSE150相比,KYSE150R细胞中Cyclin D1的表达水平明显降低（1.00±0.00 VS 0.41±0.02,P<0.001）。1.5通过分析Western blot实验结果发现:与KYSE150相比,KYSE150R细胞中Cyclin D1蛋白的表达水平明显降低（0.78±0.03 VS 0.30±0.03,P<0.001）。2.缺锌环境对食管癌细胞放射敏感性的影响及机制研究2.1确定不影响KYSE150和KYSE150R食管癌细胞增殖的TPEN浓度通过分析CCK8实验结果发现:当以0.012μmol/ml的TPEN培养基培养食管癌细胞时,KYSE150和KYSE150R细胞的增殖能力被抑制,而用0.009μmol/ml TPEN培养时,KYSE150R与KYSE150R的细胞与无TPEN培养基培养的细胞的增殖能力没有差异。因此,我们选择了0.009μmol/ml TPEN作为两个细胞系缺锌的无毒剂量。2.2通过分析克隆形成实验结果发现:在KYSE150细胞中,与普通培养基培养的细胞相比,缺锌培养的细胞的克隆形成细胞团数量更少（18.67±2.08 VS 4.67±1.53,P<0.05）。在KYSE150R细胞中,与普通培养基培养的细胞相比,缺锌培养的细胞克隆形成细胞团数量更少（26.67±7.23VS 4.33±1.53,P<0.05）。2.3通过分析流式细胞术实验结果发现:在KYSE150细胞和KYSE150R中,缺锌培养的细胞与普通培养基培养的细胞相比,凋亡率没有显著差异（P>0.05）。在KYSE150细胞中,缺锌培养的细胞与普通培养基培养的细胞相比,G0/G1期的细胞比例降低（从50%降低到32%,P<0.001）,G2/M期的细胞比例升高（从17%升高到42%,P<0.001）。在KYSE150R细胞中,缺锌培养的细胞与普通培养基培养的细胞相比G0/G1期的细胞比例也降低（从68%降低到47%,P<0.001）,G2/M期的细胞比例升高（从4%升高到38%,P<0.001）。2.4通过分析qRT-PCR实验结果发现:缺锌培养的细胞中Cyclin D1的表达水平比普通培养的细胞中Cyclin D1的表达水平更高（KYSE150:1.00±0.00VS 1.83±0.08;KYSE150R:0.41±0.02 VS 2.17±0.12,P<0.001）。2.5通过分析Western blot实验结果发现:缺锌培养的细胞中Cyclin D1的表达水平比普通培养的细胞中Cyclin D1的表达水平更高（KYSE150:0.79±0.46 VS 2.44±0.12;KYSE150R:0.3±0.06 VS 2.28±0.03,P<0.001）。3.在食管癌细胞中缺锌通过诱导miR-193b启动子甲基化导致其下调的机制研究3.1与Cyclin D1相关的miRNAs的筛选及验证3.1.1通过“Target Scan”和“miRanda”数据库筛选发现miR-193b可能与Cyclin D1相关。3.1.2通过分析免疫荧光素酶实验结果发现:与NC（1.00±0.05）组相比,Cyclin D1 3’-UTR WT组荧光活性明显减弱（0.60±0.02,P<0.05）,而与Cyclin D1 3’-UTR MUT组荧光活性表达无统计学意义（0.92±0.06,P>0.05）。3.2通过分析qRT-PCR实验结果发现:缺锌培养的细胞中miR-193b的表达水平比普通培养的细胞中miR-193b的表达水平更低（KYSE150:1.00±0.00VS 0.47±0.03;KYSE150R:1.52±0.09 VS 0.32±0.03,P<0.001）。3.3我们通过分析MSP实验结果发现miR-193b在KYSE150和KYSE150R细胞中均被甲基化。3.4通过分析Epi Seeker DNMT（DNA甲基转移酶）活性定量实验结果发现:用缺锌培养的KYSE150和KYSE150R细胞DNMT活性增强,分别增强36%和33%（P<0.05）。4.MiR-193b在缺锌环境下对食管癌细胞放射敏感性的影响及机制研究4.1通过分析克隆形成实验的结果发现:与未上调miR-193b的KYSE150细胞和KYSE150R细胞相比,上调miR-193b后的克隆形成细胞团数量更多。（KYSE150:4.67±1.53 VS 17.33±2.31;KYSE150R:4.33±1.53 VS16.67±1.11,P<0.001）。4.2通过分析流式细胞术结果发现:miR-193b的上调恢复了缺锌诱导的G0/G1期的细胞比例降低（KYSE150:32%到51%;KYSE150R:47%到52%,P<0.001）,同时也恢复了G2/M期细胞比例的升高（KYSE150:42%到14%;KYSE150R:38%到13%,P<0.001）。4.3通过分析qRT-PCR实验结果发现:在食管癌细胞中,miR-193b的上调可以恢复缺锌环境下升高的Cyclin D1表达水平（KYSE150:1.00±0.00 VS0.16±0.03;KYSE150R:1.19±0.04 VS 0.31±0.06,P<0.001）。4.4通过分析Western blot实验结果发现:在食管癌细胞中,miR-193b的上调可以恢复缺锌条件下Cyclin D1表达水平的上升（KYSE150:2.44±0.12VS 0.32±0.03;KYSE150R,2.28±0.03 VS 0.16±0.02,P<0.001）。5.血清中miR-193b的表达水平与食管癌患者预后关系的研究5.1通过分析miR-193b在食管癌患者组织中的表达水平与不同临床病理特征的关系可得,血清中miR-193b的表达水平与性别、TNM分期、吸烟情况无关（P>0.05）。血清中miR-193b的表达水平与患者的疾病控制率（DCR）相关（χ2=9.68,P=0.002）。5.2 ROC曲线分析miR-193b的预测效率表明,血清中miR-193b的相对水平对于区分EC患者的DCR具有很好的诊断价值（AUC=0.710,95%CI:0.580～0.839,P=0.003）。5.3生存曲线分析发现血清中miR-193b的表达水平与食管癌患者的总生存期（OS）相关（P=0.024）。结论:1.具有放疗抗性食管癌细胞的细胞周期在G0/G1期受阻,Cyclin D1的表达水平降低,而miR-193b的表达水平升高。这提示miR-193b可能可以通过降低Cyclin D1的表达水平来降低食管癌细胞的放射敏感性。2.缺锌可能可以通过甲基化诱导miR-193b的表达下调,miR-193b的表达下调可以使Cyclin D1的表达水平升高从而提高食管癌细胞的放射敏感性。3.食管癌患者血清中miR-193b的表达水平与患者的疾病控制率（DCR）和总生存期（OS）相关,有望成为预测食管癌预后的生物标志物。