【摘 要】
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具有共价闭合的环状RNA（circRNA）是一类新型的长非编码RNA,已经在植物,动物和人类在内的数千种生物中广泛发现。利用高通量RNA测序（RNA-seq）技术,发现许多内源性,稳定且在哺乳动物细胞中广泛表达的circRNA通常表现出细胞类型特异性,组织特异性或发育阶段特异性表达。越来越多的证据表明,某些circRNA可能调节microRNA（miRNA）作为microRNA海绵的功能,并在转录
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具有共价闭合的环状RNA（circRNA）是一类新型的长非编码RNA,已经在植物,动物和人类在内的数千种生物中广泛发现。利用高通量RNA测序（RNA-seq）技术,发现许多内源性,稳定且在哺乳动物细胞中广泛表达的circRNA通常表现出细胞类型特异性,组织特异性或发育阶段特异性表达。越来越多的证据表明,某些circRNA可能调节microRNA（miRNA）作为microRNA海绵的功能,并在转录控制中起重要作用。circRNA与相关的miRNA相关,而circRNA-miRNA参与了严重的疾病途径,如细胞凋亡、血管生成、侵袭和转移。本课题通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证circ05381在大鼠肝细胞BRL-3A/RH-35/CBRH-7919/HSC-T6细胞中的表情情况以及在肝再生七个时间点的表达变化;为进一步研究在大鼠肝再生中发挥关键作用的circ05381作深入的机理研究;首先通过慢病毒包装后侵染BRL-3A细胞、筛选得到过表达circ05381细胞株,然后通过MTT、流式细胞数、qRT-PCR和Werstern blot等方法检测过表达circ05381对BRL-3A细胞活力、表达、周期和增殖的影响,结果表明,过表达circ05381后,与对照相比,BRL-3A细胞的活力增强,在细胞周期中,自接种后48、72 h,G1期细胞比例降低,S期和G2/M期细胞比例明显增加,周期蛋白MYC和JUN等的表达量也明显升高,说明circ05381过表达促进了细胞周期进程。综上所述,circ05381过表达可以促进BRL-3A细胞的增殖。鉴于circRNA已被证明可作为miRNA海绵,通过miRanda预测circ05381相关的潜在miRNA发现这些miRNA含有circ05381区域的至少一个结合位点（共10个）:miR-1247-5p、miR-138-5p、miR-181b-1-3p、miR-210-5p、miR-326-3p、miR-330-5p、miR-3559-3p、miR-370-3p、miR-382-5p 和 miR-505-5p。由于 circ05381 和 miRNA 之间可能存在海绵功能,根据两者的时间点的表达情况,我们初步确定了 4个miRNA（miR-138-5p、miR-370-3p、miR-382-5p 和 miR-505-5p）作进一步的研究。然后在BRL-3A 细胞中观察上述四种 miRNA（miR-138-5p、miR-370-3p、miR-382-5p 和miR-505-5p）的表达,以及MTT,流式细胞术检测转染上述四种miRNA（miR-138-5p、miR-370-3p、miR-382-5p和miR-505-5p）后BRL-3A细胞的活力和周期情况,发现miR-138-5存在抑制细胞活力和周期,也就是抑制细胞增殖,而miR-370-3p则无明显抑制作用。为了进一步探究circ05381与miR-138-5p和miR-370-3p的靶向作用,本实验用双荧光素酶报告基因检测的方法来确定miR-138-5p和miR-370-3p与circ05381-WT均存在结合作用,表明circ05381是miR-138-5p和miR-370-3p的海绵。接着,本课题通过MTT和流式细胞术检测miR-138-5p和miR-370-3p的作用功能,发现miR-138-5p在细胞活力和细胞周期中都表现出与相反的细胞功能,抑制BRL-3A细胞活力和细胞增殖。而miR-370-3p则呈现的作用功能与circ05381相一致。因此本实验挑选miR-138-5p做接下来的研究。我们通过TargetScan预测和文献查询确定了miR-138-5p 的靶向 mRNA（Foxc1,Egfr,Atpllc1）,并通过 qRT-PCR 发现 Foxc1 可能是miR-138-5p的潜在靶向mRNA。
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