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研究背景:乙肝病毒（Hepatitis B Virus,HBV）是部分双链DNA病毒,可导致急性或慢性感染,引起肝炎、肝硬化甚至肝癌。HBV感染后并不直接损伤肝细胞,但能刺激机体产生免疫应答,间接造成肝细胞损伤。巨噬细胞是固有免疫的重要组成成分,也是肝脏主要组成细胞之一,在HBV感染中起着重要作用。巨噬细胞主要分为M1、M2两型,M1型发挥促炎功能,帮助机体抵御多种病原体的侵害;M2型有抗炎及促进组织修复的作用。巨噬细胞对外界环境变化十分敏感,可以迅速感应微环境的变化并改变其表型和功能,发挥相应的作用。外泌体是直径30-150 nm、形似茶杯盖的椭圆形膜性囊泡结构,分泌到细胞外后可作为载体在细胞间传递信号。大量研究表明,外泌体与病毒感染关系密切。细胞被病毒感染后引起特异性的RNA及蛋白表达,可以和病毒核酸/蛋白一起包裹于外泌体,并输送给受体细胞,发挥一系列生物学功能。但目前关于感染HBV细胞产生的外泌体影响巨噬细胞表型和功能的研究较少,需进一步探究。研究目的:1.研究感染乙肝病毒的细胞产生的外泌体对巨噬细胞表型和功能的影响。2.研究感染乙肝病毒的细胞产生的外泌体影响巨噬细胞表型和功能的分子机制。研究内容及方法:1.超速离心法结合免疫吸附法分离纯化外泌体,通过粒径分析、扫描电镜及western blot,检测其质量和纯度;通过外泌体摄取实验,检测其被THP-1细胞摄取的能力。2.将M0巨噬细胞与外泌体共培养,实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测细胞因子mRNA表达水平,酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测细胞因子蛋白表达水平;用中性红实验检测胞饮功能,用活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）试剂盒检测活性氧产生水平。3.对外泌体进行miRNA芯片测序,通过qRT-PCR进一步验证;将验证符合的microRNA mimic转染THP-1巨噬细胞,qRT-PCR检测相应microRNA及细胞因子的表达水平。4.选取miR-8088进行机制研究,通过生信分析预测其靶点,qPCR及western blot进行靶点验证。研究结果:1.电镜结果显示两组外泌体均为圆形双层膜性结构并且直径均在100nm左右;NTA结果显示提取的外泌体95%以上颗粒直径在130 nm左右;western blot结果显示外泌体蛋白表达外泌体标记物TSG101、CD81、CD63,基本不表达细胞标记物Calnexin;外泌体摄取实验证明其可以被THP-1细胞摄取。2.HBV 诱导产生的外泌体（HBV-extracellular Vesicles,HBV-EVs）可以引起 THP-1巨噬细胞IL-1β、MCP-1及TNFα表达水平显著升高,但对IL-10、MRC及NOS2等细胞因子的生成、胞饮功能和ROS生成无明显影响。3.通过miRNA芯片测序,我们发现HBV-EVs与HepG2-EVs相比有150个差异表达microRNA,其中93个显著上调,57个显著下调。选取30个microRNA加以验证,其中有12个上调和4个下调的microRNA与测序结果相符,其中miR-6824-3p、miR-8088、miR-609及miR-210-5p可以显著影响巨噬细胞细胞因子的分泌。4.生信分析、qRCR及western blot结果显示,富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（Secreted Protein Acidic And Rich In Cysteine,SPARC）,可能是 miR-8088 的作用靶点。研究结论:HBV-EVs与M0期巨噬细胞共培养后,虽然不影响巨噬细胞胞饮及产生活性氧的功能,但显著促进包括TNFα、MCP-1及IL-1β在内的多种炎症因子的表达,说明HBV-EVs促进巨噬细胞向M1型极化。miRNA芯片测序提示,感染和未感染HBV肝细胞的外泌体中microRNA表达谱有显著差异,进一步研究显示miR-8088可能通过下调SPARC,从而在HBV-EVs介导的细胞因子的分泌中发挥重要作用。这些结果提示,HBV感染后肝细胞产生的外泌体可能是调节HBV相关固有免疫,尤其是巨噬细胞表型和功能的重要途径之一。