研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是发生于老年期或老年前期的以慢性进行性不可逆记忆减退、认知障碍和人格改变为主要临床特征的大脑退行性疾病,是最常见的一种痴呆类型,其病因和病机迄今不明,治疗更缺乏有效手段。随着世界人口老龄化,其发病率呈上升趋势,严重影响患者的身心健康和生活质量,在发达国家已是导致死亡的第四位原因,故而成为全世界广受关注的一大健康难题。在AD发病机制的诸多学说中,目前β淀粉样蛋白(Amyloidβprotein,Aβ)学说仍占据主导地位。Aβ是AD特征性病理学改变——老年斑的主要成分,Aβ有不同的存在形式,已有大量研究显示,纤维状聚集的Aβ通过多种途径具有神经毒作用,在AD的形成和发展过程中起着核心和关键作用,可溶性Aβ对神经细胞作用的研究较少,有待继续深入开展。雌激素对中枢神经系统功能具有广泛和重要的作用,绝经后雌激素水平低下被认为参与了AD的发病过程,然而临床上雌激素替代治疗仍存在较大争议,雌激素在防治AD中的作用及其机制的研究有待深入进行。细胞膜流动性改变对细胞正常功能的发挥具有重大影响,同时也是反映细胞早期损伤的高灵敏度指标,Aβ对神经元膜流动性的影响国外已有少量报道,但雌激素对神经元膜流动性的影响尚未见报道。“胆碱能假说”是AD发病机制的又一重要学说,以往的研究主要集中在胆碱能神经元形态学改变及胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AchE)的生化改变方面,近年来,烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)的改变也引起了研究者的关注,Aβ与nAchR关系的研究国外已有一篇报道,但雌激素对nAchR表达的影响尚未见报道。基于以上现状,为了进一步深入探索AD可能发病机制,尤其是可溶性Aβ在AD发病中所起的作用,验证雌激素是否具有神经保护作用并探索可能的相关机制,我们进行了以下四部分的实验研究。第一部分雌激素对Aβ25—35致PC12细胞损伤的影响目的:观察可溶性Aβ25-35作用下PC12细胞细胞活力、膜通透性的改变及17β一雌二醇(17βE2)对此改变的影响。方法:1.细胞培养:PC12细胞用DMEM完全培养基(含5%胎牛血清,5%马血清,青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml),在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养,2-3天更换一次培养基,4-6天传代一次。2.实验分组:实验分为三组:(1).空白对照组, (2).Ap损伤组(以5μmol·L-1的未经老化处理的可溶性Aβ25-35作用于PC12细胞),(3).雌激素干预组:在上述Aβ25-35作用的基础上同时给予雌激素干预,雌激素选用其最主要类型1 7βE2,根据浓度梯度雌激素干预组再分为五个剂量亚组,予Aβ25-35 5μmol-L1分别加17βE2 0.1 nmol·L1,1 nmol-L-1,10 nm0l·L-1,100nmol·L-1,1000 nmol·L-1。3.MTT法检测细胞活力:将对数生长期的PC12细胞悬液,以2×104个细胞/ml的密度随机接种于96孔细胞培养板中,每孔200μl,细胞贴壁后,根据上述分组要求予以不同干预,分别继续培养0.5h,6h,24h,48h,72h。然后以MTT法用酶联免疫仪检测570nm波长下各孔的光密度值(OD570nm)。每组设6个平行样本。4.LDH法检测细胞损伤程度:PC12细胞分组、接种、干预方法同上,分别于培育各时间点收集培养液上清,用试剂盒测定LDH漏出量。5.统计方法:所有结果均为计量资料,以均数士标准差表示(X±S),组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05认为有显著性差异,P<0.01为差异性非常显著,应用SPSS10.0统计软件处理。结果:1.可溶性Aβ25-35对PC12细胞MTT还原率的影响:Ap损伤组在加入5gM可溶性Aβ25-35后各时间点,其OD570nm值较空白对照组均明显下降,PC12细胞MTT还原率均明显降低,在统计学上具有显著性差异(P<0.01);同时,5μM可溶性Aβ25-35作用于PC12细胞0.5h、6h、24h、48h、72h的动态观测显示,细胞MTT还原率曲线在6h时下降最明显(陡度最大),24h时继续下降,24h后变化不明显。2.17βE2对Aβ25-35损伤PCI2细胞MTT还原率的影响:17βE2干预组在10-10M浓度下各时间点MTT还原率与Ap损伤组比较统计学上均没有显著性差异(P>0.05);17βE2干预组在0.5h时其MTT还原率除10-6M高剂量下与Ap损伤组有显著性差异(P<0.05)外,其余10-10-10-7M浓度下其MTT还原率与Aβ损伤组比较均没有显著性差异(P>0.05);但在0.5h以后的各时间点,17βE2109-10-6M各浓度干预下PCI2细胞MTT还原率较Ap损伤组均有了显著提高(P<0.01),且这种作用具有剂量依赖性,以作用时间24h为例,Ap损伤组与空白对照组相比,PCI2细胞MTT还原率降低了29.9%,而17βE2 10-9、10-8、10-7、10-6M干预组与Aβ损伤组相比,PC12细胞MTT还原率分别提高了5.9%、10.9%、16.9%和21.9%。3.可溶性Aβ25-35对PC12细胞LDH漏出浓度的影响:Ap损伤组在加入5gM可溶性Aβ25-35后各时间点,细胞培养液上清中LDH漏出浓度均明显增高,在统计学上有显著性差异(P<0.01);同时,5μM可溶性A β 25-35作用于PC12细胞0.5h、6h、24h、48h、72h的动态观测显示,细胞培养液上清中LDH漏出浓度曲线在6h时升高最明显(陡度最大),24h时继续升高,24h后变化不明显。 4.17βE2对Aβ25-35损伤PCI2细胞LDH漏出浓度的影响:17βE2干预组在10-10M浓度下各时间点细胞培养液上清LDH漏出浓度与Ap损伤组比较统计学上均没有显著性差异(P>0.05); 在10-9-10-6M各浓度下则均有显著降低(P<0.05或P<0.01),且这种作用具有剂量依赖性,以作用时间24h为例,Aβ损伤组与空白对照组相比,PC12细胞LDH漏出浓度上升了334.92%,而17βE2 10-9、10-8、10-7、10-6M干预组与Aβ损伤组相比,PCI2细胞培养液上清中LDH漏出浓度分别降低了62.37%、117.97%、181.36%和244.07%。结论:1超生理量的A β(5 u M)即使呈可溶解状态也可以对神经元细胞造成毒性损害,使PCI2细胞代谢活力(MTT还原率)明显降低;使PCI2细胞膜完整性受到损伤,培养液上清中LDH漏出明显增多;以上损伤出现较早,并随着时间的延长而加剧。2可溶性A β 25-35作用于PC12细胞可作为AD早期病理损害的细胞模型。3雌激素具有明显的抗A β损伤和神经细胞保护作用,10-9-10-6M 17 β E2对A β 25-35所造成的PCI2细胞MTT还原率下降、LDH漏出浓度升高具有明显的逆转作用,且这种作用具有剂量依赖性。第二部分雌激素对Aβ25—35致PC12细胞膜流动性改变的影响目的:观察可溶性Aβ25—35作用下PC12细胞膜流动性的改变及17βE2对此改变的影响。方法:1.细胞培养:同前。2.实验分组:同前。3.荧光偏振法检测PC12细胞膜流动性:将对数生长期的PC12细胞悬液,以2×105个细胞/ml的密度接种于6孔细胞培养板中,每孔2ml,细胞贴壁后根据分组要求予以不同干预,继续培养0.5h,6h,24h,48h,72h。然后以Hanks液清洗、收集细胞,以1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene,DPH)荧光探针负载PC12细胞悬液(DPH终浓度为2×10-6mol/L,避光,37℃,温育30min),用荧光分光光度计测定各样品荧光强度值IVV、IVH、IHH、IHV,测定条件为:激发波长362nm,发射波长432nm,激发狭缝10nm,发射狭缝10nm,温度(25±0.5)℃。计算荧光偏振度(fluorescence polarization)P和微粘度(microviscosity)η值。每组设4个平行样本。4.统计方法:同第一部分。结果:1.可溶性Aβ25—35对PC12细胞膜流动性的影响: Aβ损伤组在加入5μM可溶性Aβ25-35后各时间点,其P、η值均明显升高(P<0.01);同时,5μM可溶性Aβ25—35作用于PC12细胞0.5h、6h、24h、48h、72h的动态观测显示,其升高的荧光偏振度P和微粘度η与相应的空白对照组之比值曲线在0.5h时上升最明显(陡度最大),6h及24h时继续上升,24h后变化不明显。2.17βE2对Aβ25—35致PC12细胞膜流动性改变的影响: 17βE2干预组在10-1oM浓度下各时间点其P和η与Aβ损伤组比较统计学上均没有显著性差异(P>0.05);而在10-9-10-6M浓度下各时间点P和η与Aβ损伤组比较均显著降低(P<0.01或P<0.05),且这种作用具有剂量依赖性,以作用时间24h为例,Aβ损伤组与空白对照组相比,PC12细胞荧光偏振度P升高了32.2%,微粘度η升高了89.6%;而17βE2 10-9、10-8、10-7、10-6M干预组与Ap损伤组相比,PC12细胞荧光偏振度P分别降低了10.3%、14.9%、19.0%、22.3%,微粘度η分别降低了36.4%、49.6%、60%、68.4%。结论: 15μM可溶性Aβ25—35使PC12细胞膜流动性明显下降,荧光偏振度和微粘度明显升高,这种改变比MTT、LDH更加灵敏,在超早期即出现,并随着时间的延长而加剧,为Aβ膜毒理学提供了新的证据; 2雌激素具有改善膜流动性的神经元保护作用,且这种作用具有剂量依赖性,该作用国内外尚未见报道,为雌激素作用机制增添了新的内容。第三部分雌激素对Aβ25—35致PC12细胞自由基代谢改变的影响目的:观察可溶性Aβ25—35作用下PC12细胞自由基代谢的改变及17βE2对此改变的影响。方法:1.细胞培养:同前。2.实验分组:同前。3.PC12细胞胞浆丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽过氧物酶(GSH—PX)活力的检测:将对数生长期的PC12细胞悬液,以5×105个细胞/ml的密度接种于6孔细胞培养板中,每孔2ml,细胞贴壁后根据分组要求予以不同干预,分别继续培养24h。上述细胞用PBS洗3遍,制成悬液,离心收集后加裂解液裂解,制备胞浆液。用TBA法,按照试剂盒说明测定PC12细胞胞浆MDA水平:用DTNB法,按照试剂盒说明测定PC12细胞胞浆GSH-PX活力。每组设5个平行样本。4.统计方法:同第一部分。结果:1.17βE2对可溶性Aβ25—35致PC12细胞胞浆MDA水平改变的影响:5μM可溶性Aβ25-35作用于PC12细胞24h后明显增加了胞内MDA的含量,与空白对照组相比,具有显著性差异(P<0.01);而Aβ25—35所致的MDA的增加能被不同浓度的17βE2(10-10-10-6M)所逆转(P<0.01或P<0.05),且17βE2的这种作用呈剂量依赖性。2.17βE2对可溶性A 0 25—35致PCI2细胞胞浆GSH—PX活性改变的影响:5μM可溶性Aβ25-35作用于PCI2细胞24h后,胞内抗氧化酶GSH-PX活性较空白对照组明显降低(P<0.01),而不同浓度的17βE2(10-10-10-6M)可明显逆转GSH-PX活性的下降(与Aβ25-35组对比,P<0.01或P<0.05),且17βE2的这种作用呈剂量依赖性。结论:15μM可溶性Aβ25-35可引起PC12细胞自由基生成增多,胞内MDA含量明显增加,并破坏细胞自由基清除系统使其抗氧化能力下降,胞内抗氧化酶GSH-Px活性明显降低,导致氧应激损伤,这可能是可溶性Aβ25-35对PC12细胞损伤作用及其导致膜流动性下降的原因;2雌激素具有调动机体抗氧化酶活性和自由基清除能力、降低自由基水平的抗氧化功效,17βE2能有效逆转Aβ25—35所致PC12细胞MDA的增加及GSH-PX活性的下降,这种作用呈剂量依赖性,雌激素抗氧化损伤作用可能是其神经保护作用的基础。第四部分雌激素对Aβ25—35致PC12细胞nAchR受体表达改变的影响目的:观察可溶性Aβ25—35作用下PCI2细胞nAChRα7亚基蛋白表达水平的变化及17βE2对此变化的影响。方法:1.细胞培养:同前。2.实验分组:实验分为三组:(1).空白对照组,(2).Aβ损伤组,(3).雌激素干预组,雌激素干预组又分为四个剂量组(17βE2 1 nM,10 nM,100 nM,1000 nM),处理方法同前。3.间接免疫荧光染色(indirect IF staining)法观察PCI2细胞nAChRα7的变化:(1)PC12细胞的接种与干预:盖玻片用多聚赖氨酸包被后放入24孔细胞培养板中,将对数生长期的PC12细胞悬液,以2×104个细胞/ml的密度接种于上述24孔培养板中,每孔1ml,细胞贴壁后根据分组要求予以不同干预,分别继续培养72h。(2)间接免疫荧光染色:PC12细胞经固定、透化、封闭、一抗反应、二抗反应后封片,在荧光显微镜下观察拍照。4.Western-blot法检测PC12细胞nAChRα7蛋白表达水平的变化:(1)PC12细胞的接种与干预:将对数生长期的PC12细胞悬液以2×105个细胞/ml的密度接种于用多聚赖氨酸包被过的6cm培养皿中,每皿4ml,细胞贴壁后根据分组要求予以不同干预,分别继续培养72h。(2)nAChRα7的Western-blot检测:使用裂解液配合超速离心的方法提取膜蛋白→BCA法进行蛋白定量→用SDS—loading buffer变性→SDS-PAGE电泳(12%分离胶,5%积层胶,每孔上样40μl)→石墨半干电转至PVDF膜上→5%脱脂奶粉封闭(2hr)→与一抗反应(1:500,40C过夜)→与HRP标记的二抗反应(1:5000,1 hr)→ECL发光→显影→定影→Koda凝胶成像系统对胶片进行灰度扫描,以空白对照为100%求得各组蛋白表达的相对值。实验重复4次。5.统计方法:Western-blot灰度扫描结果用于半定量分析,方法同第一部分。结果:1.PCI2细胞nAChR α 7免疫荧光染色结果: nAChR α 7在各组PCI2细胞上均有染色,为绿色荧光,主要分布于细胞表面,呈环状,各组PC12细胞nAChR α 7荧光强度存在差异,以正常对照组最强,5μM可溶性Aβ25-35作用于PCI2细胞72h后nAChR a 7荧光强度明显减低,不同浓度的17βE2(10-9-10-6M)与Aβ25-35共同作用PCI2细胞72h后nAChR α 7荧光强度呈不同程度的增强。2.17 β E2对可溶性Aβ 25—35致PCI2细胞nAChR α 7蛋白表达水平改变的影响(Western-blot结果): 5μM可溶性Aβ25-35作用于PC12细胞72h后nAChR a 7蛋白表达水平较空白对照组明显下降(65%,P<0.01),而不同浓度的17βE2(10-9-10-6M)与5μM可溶性Aβ25-35共同孵育PCI2细胞72h后nAChR α 7蛋白表达水平较A β损伤组均不同程度上调,具有显著性意义(P<0.01),呈剂量依赖性。结论:1 首次采用间接免疫荧光技术观察到nAChR α 7主要分布于PCI2细胞膜表面,并发现5 u M可溶性A β 25-35作用于PCI2细胞72h后nAChR α 7荧光强度明显减低, 10-9-10-6M 17βE2则使其荧光强度呈不同程度的增强,说明可溶性Aβ25-35对PCI2细胞α 7nAChR表达具有抑制作用,而雌激素则具有促进作用;2 Western-blot半定量检测进一步证实了5 u M可溶性A β 25—35使PCI2细胞nAChRα 7蛋白表达水平明显下降,并首次发现17βE2对nAChR α 7表达具有明显上调作用,且呈剂量依赖性。