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2型糖尿病(T2DM)是一种受多因素影响的复杂代谢性疾病。多种组学联合分析方法为T2DM发病机制探索、疾病早期诊断和动物疾病模型制作等方面研究提供新的解决方案。本试验通过构建广西巴马小型猪T2DM发病模型和未发病模型,利用RNA-seq和iTRAQ技术进行模型肌肉组织转录组学和蛋白组学分析,以探讨巴马小型猪T2DM的发病机制,为系统地从生物学角度进行T2DM的研究提供新的思路。本试验选取年龄相似(6-7月龄)、体重相近(20公斤左右)广西巴马小型猪40头(母猪18头和去势公猪22头)。随机选取9头作为对照组(CON)和31头作为试验组。对照组饲喂基础饲料,试验组饲喂高脂高糖饲料(由60%基础饲料、35%蔗糖和5%猪油组成)。高脂高糖饲料饲养巴马小型猪12个月后,试验组筛选出6头多次出现血糖和静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)表现异常的小型猪作为发病组(T2D),6头血糖和IVGTT表现正常的小型猪作为未发病组(NT2D),并利用RNA-seq技术和iTRAQ技术对巴马小型猪背最长肌进行转录组测序和蛋白组学分析。主要试验研究结果如下:1、广西巴马小型猪T2DM模型制作与NT2D个体相比,T2D个体出现空腹血糖增加、血脂代谢异常、HOMA-IR指数和HOMA-ISI指数的绝对值显著增加(p<0.05),IVGTT试验葡萄糖耐受能力下降;T2D个体肝脏、肾脏和胰腺病理切片呈现T2DM的病变。2、巴马小型猪骨骼肌转录组分析NT2D组和CON组的差异基因有290个,T2D组和CON组的差异基因有572个,T2D组和NT2D组的差异基因有300个;从转录组中筛选的 PGC1α、NR4A3、CSRP3、MYH7、MYH2、MYH1、GLUT4、PPARγ、LEP、ATP5H、UCP2 和 MTOR 基因的 mRNA 表达量的 qPCR检测结果与RNA-seq结果一致。KEGG分析显示,三组差异基因主要涉及了代谢、疾病、炎症、免疫、基因修饰、细胞骨架和信号传递等相关信号通路;其中,T2D组和NT2D组的差异基因主要涉及心血管疾病、感染性疾病和癌症等疾病相关的信号通路、炎症反应和免疫作用有关的信号通路以及与细胞骨架和信号传递过程相关的信号通路。T2DM巴马小型猪转录组与人T2DM患者转录组(GSE29221)比较分析发现有17个共同的差异基因,主要涉及了脂肪细胞因子和肥大型心肌病信号通路;对T2DM猪和人T2DM患者转录组差异基因注释到的信号通路进行比较,获得6条相同的信号通路,分别是疾病(肥大型心肌病、扩张型心肌病和甲状腺癌)、细胞骨架(心肌收缩和紧密连接)和信号传递(钙信号通路)相关信号通路,提示可利用巴马小型猪T2DM模型进行人类T2DM这六个信号通路的研究。3、巴马小型猪骨骼肌蛋白质组学差异分析T2D组与NT2D组的差异蛋白有13个,其中1个蛋白表达上调,12 个蛋白表达下调。LUM、DCN、OGN、PRELP、BGN 和 CSRP3的蛋白表达量的PRM检测结果与iTRAQ结果一致。差异蛋白的功能和通路分析显示,GO分析发现大多数差异蛋白属于细胞外基质蛋白,KEGG分析发现差异蛋白涉及了炎症和疾病(癌症蛋白多糖、疟疾、吞噬体和焦点黏着)、代谢(2-氧代羧酸代谢,泛酸盐和辅酶a生物合成,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解,氨基酸的生物合成,蛋白质消化和吸收)以及信号传递(TGF-β信号通路、ECM受体相互作用、PI3K-Akt信号通路)3个方面的信号通路。蛋白组与转录组联合分析发现,有1641个基因在蛋白组和转录组中相互关联,其中13个属于差异蛋白,95个属于差异基因,CSRP3基因在蛋白组和转录组中均存在显著差异表达(p<0.05);联合分析结果显示,蛋白组和转录组中相互关联的基因主要参与了代谢、遗传和环境信息、细胞和有机体系统及人类疾病等相关信号通路,提示了T2DM发生机制的复杂性。4、巴马小型猪骨骼肌CSRP3基因的克隆和功能研究广西巴马小型猪CSRP3基因的CDS序列大小为585bp,与NCBI上公布的CDS序列同源性为99.7%,有四处碱基发生同义突变。CSRP3基因的表达水平研究显示,T2D组的表达水平低于NT2D组,CSRP3基因的表达变化趋势与MYHC1最相似,与MYHC1、MYHC2A和MYHC2X呈正相关,与MYHC2B呈负相关。CSRP3基因与TG、TC、HDLC和LDLC等整体呈正相关关系,与ISI指数呈负相关关系,除了 1M时与TG显著正相关(p<0.05),CSRP3基因和T2DM相关指标在1-11M期间相关不显著(p>0.05);在12M时与FBG、INS和IR指数等呈显著正相关(p<0.05),而与ISI指数呈显著负相关(p<0.05),提示在T2DM发展末期,CSRP3的基因表达水平可以成为T2DM的标志。CSRP3基因过表达和干扰试验结果表明,过表达CSRP3基因可以显著下调IRS1、AKT1、GLUT4和LPL等基因(p<0.05),抑制CSRP3基因的表达可以显著上调LPL基因和显著下调IRS1基因的表达(p<0.05)。综上所述,本研究成功构建了巴马小型猪T2DM模型,该模型骨胳肌的代谢、信号传递、炎症和疾病等通路的转录水平和蛋白水平发生了变化,这些变化是导致T2DM发生的重要原因。CSRP3基因表达水平的下降,可以上调LPL基因表达和下调氧化型肌纤维类型相关基因表达,从而影响骨骼肌纤维类型转化、脂肪储存和氧化代谢能力,这可能是CSRP3基因影响T2DM发生的主要途径之一。