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在成人的深度创面修复的过程中,疤痕形成或纤维化产生是不可避免的结局,难以达到无瘢痕愈合。由于瘢痕可致躯干、四肢的形态及功能异常,引起不同程度的心理障,严重影响了患者的生活质量,是临床上面临的主要问题,如何有效的控制瘢痕的增生及其相关机制研究一直是研究的热点、难点问题之一。大量的文献表明,巨噬细胞作为一种免疫细胞,通过分泌某些因子,在创面修复及后期的纤维化发生都起到了促进作用。巨噬细胞具有吞噬病原菌、分泌炎性因子、生长因子等发挥抗炎、清除坏死组织、促进创面愈合等功能。近年来通过消化的方法从人和鼠的创面分离巨噬细胞表明在组织修复过程中,在不同的环境刺激下,巨噬细能获得多种表型和不同的功能。在创面愈合过程巨噬细胞能表达M1和M2型标记。创面愈合的炎症反应期主要为M1巨噬细胞,主要分泌炎症介质发挥抗炎作用。创面愈合的中后期主要为M2巨噬细胞,主要分泌大量的生长因子发挥促生长作用。真核起始因子6(eIF6,Eukaryotic initiation factor 6)是一种新发现的能够对真核生物蛋白质翻译起调控作用的因子。在细胞核中,eIF6是核糖体生成不可缺少的一种因子,同时在胞浆中,eIF6与60s亚基聚合形成聚合物,发挥抗结合作用,阻止40S亚基与60S亚基结合,防止成熟的80S亚基形成。这一过程受RACK1-PKC复合物调控,40S亚基通过RACKI与PKC形成复合物,然后PKC将eIF6 Ser 235磷酸化,从而将eIF6从核糖体60s亚基解聚下来,从而形成成熟的80S核糖体亚基,mRNA开始翻译组装肽链。课题组前期的实验发现eIF6对皮肤创面的纤维化具有抑制作用。通过建立eIF6野生型与eIF6+/-两组小鼠创面愈合的线性模型,结果显示：eIF6+/-组小鼠创面肉芽组织增加、胶原沉积增加。同时在肝纤维化模型中,高表达eIF6组胶原沉积明显少于对照组。因此我们推测,eIF6可能影响巨噬细胞的功能进而影响创面愈合。我们拟通过基因芯片技术比较eIF6野生型与eIF6+／-来源的M2巨噬细胞基因表达谱差异,进而探讨eIF6影响M2巨噬细胞的哪些关键基因。研究内容和方法1、巨噬细胞及M2型巨噬细胞培养通过分离eIF6野生型与eIF6+/-小鼠腹腔巨噬细胞,细胞培养箱培养24小时后获得贴壁的树枝状细胞就是我们所需巨噬细胞。然后更换加入IL-4的培养基继续培养24小时,收集细胞。2、M2型巨噬细胞表型及功能鉴定用流式细胞仪检测M2巨噬细胞的表面抗原,用RT-PCR检测M2型巨噬细胞的精氨酸酶1(arginase-1)和TGF-β1的表达水平的表达。3、基因芯片筛选差异基因 将分别来自eIF6野生型与eIF6+/-小鼠的M2巨噬细胞抽提RNA,干冰保存,送至英潍捷基(上海)贸易有限公司检测。实验所选芯片为(Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array)表达谱芯片,实验均进行三次生物学重复4、RT-PCR及ELISA：通过提取细胞RNA及培养液上清,用RT-PCI及ELISA从基因RNA及蛋白水平验证部分感兴趣的差异基因。实验结果1、通过腹腔灌洗将巨噬细胞的分离,经过24小时培养纯化后,获得贴壁的树枝状细胞,即为初步分离的腹腔巨噬细胞,经检测发现F4/80和CD11b两种巨噬细胞表面标记均为阳性,纯度为94.4%。2、IL-4刺激巨噬细胞24小时后,流式细胞检测发现,CD206表达明显增强,而未见CD11c表达。3、RT-PCR检测发现,arginase-1和TGF-β1在IL-4刺激组显著高于未刺激组。(P<0.05)。4、通过基因芯片(Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array)对eIF6野生型与eIF6+/-M2巨噬细胞表达谱进行检测,筛选差异基因。挑选出与纤维化相关的差异基因VEGF, MMP2和TIMP2。eIF6+/-eIF6野生型之间差异基因比值分别为：VEGF(比值1.33, p<0.05)、MMP2(比值0.70,p<0.05)、TIMP2(比值1.54,p<0.05)5、RT-PCR对芯片结果进行验证elF6+/-与-eIF6野生型相比,VEGF、TIMP2 RNA表达上升(P<0.05),MMP2表达下降(P<0.01),与基因芯片结果吻合6、ELISA对芯片结果进行验证eIF6野生型与eIF6+/-相比,VEGF、TIMP2表达明显上升(P<0.05),MMP表达下降(P<0.01),与基因芯片结果吻合。结论eIF6敲降后可促进M2型巨噬细胞产生VEGF,刺激血管内皮细胞分化增生形成新生毛细血管,有利于肉芽组织生长,同时可调节金属蛋白酶2及其抑制物(MMP2/TIMP2)之间的比例,参与外基质降解代谢,影响纤维化(疤痕)的程度。