随着移植免疫学研究深入,围手术期免疫诱导治疗成为器官移植领域的研究热点。单克隆抗体免疫诱导剂的应用,显著降低了急性排斥发生率,提高了中短期移植成功率。在种类众多的免疫诱导剂中,最受关注的是人源化抗CD52单克隆抗体(Campath-1H)。Campath-1H最早在临床上当作淋巴细胞清除剂使用,主要治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)及术后移植物抗宿主病(GvHD).随后,移植学家将Campath-1H引入肾移植围手术期间的免疫诱导治疗,使患者可以摆脱长期激素维持治疗,并可逐步减少其它免疫抑制剂的使用量。此后,Campath-1H的免疫诱导效应得到了移植学界的重视,在实体器官移植,特别是最为困难的小肠移植中的应用比例逐渐上升。尽管目前基于Campath-1H的免疫诱导方案得到美国三大移植中心的认可,但是对其使用的剂量、频度和诱导后维持用药的选择仍存在较大争议。Campath-1H自身的作用时效、对主要淋巴器官的作用强度及免疫诱导效应是解决上述纷争的重要依据。由于缺乏有效的动物模型,目前此项研究仍为空白。本研究采用非人灵长类动物食蟹猴为实验动物模型,给予Campath-1H处理后进行了药代动力学研究；同时研究了给药前/后外周血多种免疫细胞清除和重建的规律；又进一步探讨了Campath-1H对初级和次级免疫器官内淋巴细胞的作用规律；并且阐明了Campath-1H免疫诱导效应的具体作用机制。本文旨在探索阐明Campath-1H诱导后免疫系统的顺应性改变及免疫诱导效应的作用机制,为临床上科学应用Campath-1H提供实验依据。第一章建立Campath-1H免疫诱导的动物模型及药物代谢动力学研究背景：尽管c ampath-1H越来越多地应用于实体器官移植的免疫诱导治疗,但对其确切的药代动力学特征及免疫诱导效应仍不清楚。由于Campath-1H是人源化抗体,具有种属特异性,目前尚无有效的动物模型可供研究。此研究部分,建立了食蟹猴Campath-1H免疫诱导模型,并研究Campath-1H的药物代谢动力学特征。方法：选取成年雄性食蟹猴,抽取静脉血做血常规。用Ficoll密度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞(PBMC)及红细胞(RBC)。与CD52荧光抗体共孵育,采用流式细胞仪检测不同细胞表面CD52抗原密度。筛选出RBC表面CD52阴性表达的食蟹猴15只,用于Campath-1H免疫诱导研究。将食蟹猴分成5组,每组3只分别在3d、9d、14d、21d、35d处死,获取标本。采用ELISA法测定血清游离Campath-1H浓度,计算其代谢动力学参数。数据用Graphpad 5.0分析,组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)及Dunnett t检验,检验水准α=0.05。结果：食蟹猴外周血淋巴细胞、单核细胞表面均有高密度CD52抗原表达,接近40%食蟹猴红细胞表面不表达CD52,可入组本实验研究。外周血常规显示,Campath-1H给药后lhr即出现大量的淋巴细胞清除,到给药后9d淋巴细胞计数降至最低(1.03±0.31×109/L vs给药前5.04±0.48x109/L,p<0.01),到35d逐渐恢复到给药前水平。单核细胞、NK细胞也可被快速清除,但弱于Campath-1H对淋巴细胞的清除效果,而且恢复快于淋巴细胞。进一步的流式细胞学分析表明：淋巴细胞CD52表达密度>单核细胞>NK细胞。药代动力学研究表明,Campath-1H在食蟹猴体内代谢特征表现为双相衰减动力学过程,血清平均峰浓度为8.8±1.8ug/ml(给药后1hr),0级清除相最大清除速率为Vmax=35.525ng/ml-hr,末端清除半衰期为9.89d。结论：本研究表明食蟹猴可作为Campath-1H免疫诱导作用研究的有效动物模型。Campath-1H可诱导食蟹猴出现快速、剧烈的外周血免疫细胞清除。Campath-1H的清除效能与靶细胞表面CD52抗原密度有关。第二章Campath-1H对食蟹猴主要淋巴组织内淋巴细胞的作用研究背景：目前对Campath-1H的研究局限于其对外周血淋巴细胞的影响,而对淋巴器官内免疫细胞的作用时效尚无研究。此研究部分观察了Campath-1H诱导前/后,初级(骨髓)和次级淋巴器官(脾脏、淋巴结)内淋巴细胞数量的动态改变。方法：雄性食蟹猴,3-5岁龄,体重3-7kg,筛选红细胞表面CD52阴性的食蟹猴15只入组实验,分组如前。Campath-1H诱导前每只食蟹猴给予静滴100m1生理盐水后,抽取外周血、骨髓,作为自身对照的基线水平。依据预实验数据,每只食蟹猴静脉给予Campath-1H (3.0mg/kg),到给定时间点处死动物,再次留取标本。用流式细胞仪分析了Campath-1H对骨髓造血干细胞和淋巴系祖细胞的不同清除作用；用机械解离法获取脾脏、淋巴结的淋巴细胞,进而分析了淋巴细胞数量和亚群比例的改变。数据用Graphpad 5.0软件分析；组间差异采用单因素方差分析(ANOVA, LSD) 及Dunnett t检验,检验水准α=0.05。结果：骨链流式结果表明,Campath-1H对食蟹猴多能造血干细胞(p-HSC)和定向造血干细胞(c-HSC)没有显著清除作用。与给药前相比,Campath-1H对T细胞定向祖细胞(T-HPC)有清除作用。骨髓涂片分析示：原始及幼稚淋巴细胞比例在Campath-1H诱导初期后(9d)有迅速下降,但恢复较快。Campath-1H也显著清除脾脏、淋巴结的淋巴细胞。但与外周血相比,脾脏淋巴细胞的数量降幅较小(3d最低,约基线的32%),淋巴结淋巴细胞数量降低较慢(9d最低,降至约40%)。流式细胞学分析示,残存的记忆性淋巴细胞占总淋巴细胞的比例升高。到诱导后35d,脾脏、淋巴结淋巴细胞数量均已恢复到给药前基线水平。结论：Campath-1H对食蟹猴的初级及次级淋巴器官均有影响。Campath-1H不影响骨髓造血干细胞,但对T细胞定向祖细胞有清除作用,这可能是T细胞延迟恢复的重要原因。Campath-1H对次级淋巴组织的淋巴细胞清除作用稍弱,可能与其对记忆性淋巴细胞的清除较差有关。第三章Campath-1H免疫诱导的相关机制研究背景：由于调节性T细胞和效应性T细胞的相对比例决定着机体的免疫状态。关于Campath-1H对上述两类细胞的作用仍无系统研究。本研究部分主要观察应用Campath-1H后,食蟹猴血液内效应性淋巴细胞和调节性淋巴细胞各亚群的变化以及Thl/Th2细胞因子的组成改变。通过观察细胞和效应分子水平的变化,阐明参与Campath-1H免疫诱导的具体机制。方法：动物筛选、分组、给药、标本采集如前。本部分采用流式细胞学手段,分析了调节性T淋巴细胞及效应性T细胞在诱导前/后相对比例的动态变化；同时,也分析了记忆/初始细胞不同亚群数量的动态改变。进一步深入到细胞因子水平,我们用ELISA法检测诱导前/后外周血IL-2、IL-10、IFN-γ浓度改变。数据用Graphpad 5.0统计软件分析,组间差异采用单因素方差分析(ANOVA, LSD)及Dunnett检验检验水准α=0.05。结果：Campath-1H显著改变外周血淋巴细胞亚群比例的变化。在Campath-1H诱导初期,随着总淋巴细胞数量的下降,调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+, Treg)的相对比例显著升高,而效应性T细胞(CD4+CD25-/low, Teff)显著下降。Treg/Teff比例呈现先上升后逐渐回落趋势。ELISA检测结果示：Th1/Th2因子比例出现类似变化。相比Thl因子IFN-γ,血清中主要的Th2因子IL-10在给药初期也出现显著升高,表现为IL-10/IL-2比例快速升高,但随后这种优势逐渐减弱。进一步研究表明,记忆细胞是清除后淋巴细胞重建的主要亚群,在诱导末期,Campath-1H不能抑制效应性记忆T细胞(CD4+CD28-CD95+, Tem)的快速升高。结论：Campath-1H通过差异性清除作用显著影响调节性T细胞和效应性T细胞的比例,且显著增加Th2细胞因子IL-10的浓度。因此,Campath-1H诱导可导致机体的免疫低应答状态。但Campath-1H对记忆性T细胞清除较差,诱导后期不能有效抑制效应性记忆T细胞的升高,是免疫低应答状态无法稳定维持的重要原因。