昆虫是自然界中数目最多的动物,主要得益于其多种多样的生存与变态方式。在长期的进化过程中,昆虫通过幼虫的数次蜕皮、幼虫到蛹及蛹到成虫的变态,其外部形态、生活习性、生理特征以及内部器官等方面发生一系列的改变,这些变化基本都受到了保幼激素JH与蜕皮激素20E的严格协同作用,其中JH维持幼虫的生长,20E帮助幼虫蜕皮以及幼虫到蛹的生理变态。现阶段人们对于这两种激素的研究主要集中在它们参与下游转录调控通路的分子机制上,但对于激素合成、代谢途径中涉及到的关键酶的结构学基础和酶学机制研究较少。家蚕作为一种重要的经济昆虫,同时又是鳞翅目模式生物之一,关注其激素合成代谢通路的关键酶,寻找有效的抑制剂,不仅有助于进行调控家蚕生长发育,提高家蚕的经济性状,还能为害虫的生物防治和新型农药开发提供重要靶标。本研究关注于家蚕保幼激素合成途径中的关键限速酶——保幼激素酸甲基转移酶(Juvenile hormone acid methyltransferase,JHAMT),系统鉴定家蚕中JHAMTs家族的组成及分布;并通过蛋白质三维结构解析帮助我们从原子水平阐明JHAMT的催化机制,并找到昆虫JHAMTs催化JH合成的结构学基础和通用规律;为找寻新型环保生物杀虫剂,特别是鳞翅目害虫杀虫剂的开发提供结构依据。现阶段,获得如下研究结果:1.家蚕BmJHAMTs基因的生物信息学与表达模式分析首先利用生物信息学分析方法对昆虫JHAMTs蛋白进行了系统进化分析及多序列比对,发现家蚕体内一共存在7种形式BmJHAMTs基因,分别是BmJHAMT,BmJHAMT_L1-L6。进化树结构显示,家蚕BmJHAMTs家族的基因与鳞翅目昆虫的JHAMT聚为一个大支,其中BmJHAMT与蓖麻蚕的JHAMT聚为一支,其进化上较为相似,而其他几种形式的BmJHAMTs则单独聚为一个小支,暗示家蚕的JHAMT家族在长期选择进化的过程中保守性不是太高。多序列比对发现,该家族蛋白同源性在36-44%左右,都具有保守的S-adenosyl-L-methionine(SAM)结合结构域。利用RT-qPCR实验对BmJHAMTs家族蛋白基因的时期与组织表达模式进行了分析。时期表达谱结果显示,BmJHAMT和BmJHAMT_L1的变化模式很相似,即在幼虫期时表达量较低,蛹期高量表达,且存在每龄初期高量表达而末期基本不表达的趋势,这和保幼激素的滴度变化情况吻合。BmJHAMT_L2与BmJHAMT_L3基本都在幼虫期高量表达;BmJHAMT_L4在幼虫期1龄到3龄时期基本不表达,而在4龄和5龄时期表达量较高,且表达模式与保幼激素的变化情况相似;BmJHAMT_L6基因在幼虫时期表达,蛹期和成虫时期基本不表达。组织表达谱结果显示,无论是四龄第2天亦或是五龄第4天,BmJHAMT在咽侧体里较高量表达,BmJHAMT_L1在各个组织中基本都有所表达,BmJHAMT_L2与L3在丝腺中表达量较高,BmJHAMT_L4与L6在脂肪体、表皮、中肠等有表达,这与之前文献报道的JHAMT在咽侧体里面特异表达存在差异,暗含其他组织可能也有保幼激素再合成的能力,即催化保幼激素酸到保幼激素。2.家蚕BmJHAMTs蛋白原核表达、纯化及体外酶活分析根据表达模式结果,选取四龄第2天的咽侧体、脂肪体和丝腺的混合cDNA为模板成功克隆了BmJHAMT、BmJHAMT_L1-L4以及BmJHAMT_L6基因,并将其成功构建到原核表达载体中。对这6种BmJHAMTs蛋白进行表达检测,发现它们均能在16℃条件下以可溶形式表达,再利用镍柱亲和层析及凝胶过滤层析分别对原核表达的重组JHAMTs蛋白进行纯化,获得了大量较纯的重组JHAMTs蛋白,为后续进一步的酶活实验和结晶实验奠定了基础。利用高效液相色谱技术HPLC以商业化、有活性底物法尼酸FA(JH acid的类似物)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为底物检测重组JHAMTs的催化活性。实验结果显示,BmJHAMT有明显的酶活催化活性,BmJHAMT_L1具有催化活性,但其活性明显低于已报道的BmJHAMT,而BmJHAMT_L2、L3、L4以及L6蛋白暂时没有体外酶活,推测可能存在如下原因:1.原核表达系统不存在对这几种形式蛋白的转录和翻译后修饰过程,所以导致其在体外实验中没有催化活性;2.可能这几种蛋白在体内存在像酶原激活一样的途径;3.可能这几种蛋白并非是真正的保幼激素酸甲基转移酶。3.家蚕BmJHAMTs蛋白结构解析与酶活机制初探保幼激素合成通路是昆虫特有的,其合成通路的关键酶JHAMT的三级结构在所有的昆虫中都未得到解析。为了获得昆虫首个JHAMT的三级结构,我们采用商业化的Hampton research生产的筛选试剂盒对获得的6种BmJHAMTs蛋白进行晶体筛选,后续进行晶体优化与X射线衍射,最终解析了BmJHAMT_L1、BmJHAMT_L1-SAM复合体、BmJHAMT_L2的三维结构。通过结构解析,发现BmJHAMT_L1和BmJHAMT_L2蛋白属于I型甲基转移酶,有类似的α/βRossman的超折叠结构,7条链β-折叠链被两侧的α-螺旋区域围绕,形成SAM底物结合中心,上端α-螺旋区域会形成一个类似于―盖子‖的形状,推测可能会与其特异底物FA或JHA的结合有关。分析JHAMT_L1与SAM复合的结构发现,SAM的加入会使JHAMT_L1构象发生明显的变化:即第111位到第119位氨基酸形成的无规则卷曲部分(Loop区)向下的翻折,有利于SAM分子的固定,同时此构象变化促使底物催化中心的形成。接着,我们对与SAM氢键相互作用的氨基酸进行了结合常数Kd的测定,发现将68位的Asp与113位的Thr突变后其结合能力明显降低,说明这些位点在直接参与了SAM分子的结合与固定。SAM-JHAMT-JHA的三元复合物晶体筛选尚未获得,我们采用分子对接的手段,对底物JHA与SAM-JHAMT进行了三维空间的模拟,结果显示,Gln15、His115与Trp116与底物JHA所形成的氢键作用力起固定JHA羧基端取向的作用;同时147位Val,148位Phe,205、207位的Asp,216、256位的Leu形成较大疏水口袋方便JHA尾部长链C原子的进入。对接结果满足能量最低原则与相关约束条件,后续将对这些位点进行的定点突变和酶活实验验证,并初步得到BmJHAMTs酶活催化机制。