肺癌是目前全世界最常见的恶性肿瘤，其死亡率居世界首位。非小细胞肺癌是肺癌中最常见的一类，多数非小细胞肺癌的细胞中均有表皮生长因子受体（EGFR）和该家族别的成员表达。EGFR是跨膜受体型酪氨酸激酶家族的一员，EGFR家族（ErbB家族）主要有四名成员，在肺癌的发生和发展中发挥重要的作用，目前以EGFR为治疗靶点的靶向治疗取得了令人鼓舞的成就。小分子EGFR受体型酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如厄洛替尼和吉非替尼已开展了较为深入的临床试验。这两种药物对10%-20%的非小细胞肺癌患者有较为明确的治疗效果。但是，临床结果证实，多数患者在治疗一段时间后出现耐药。目前认为肿瘤细胞能通过多种单独或者联合的途径获得耐药的能力，现阶段比较公认的机制主要有：EGFR基因获得性二次突变，MET基因异常高扩增以及HGF异常高表达等。目前肿瘤耐药已经成为肿瘤治疗中最大的障碍，对肿瘤联合用药有非常好的治疗前景，我们期望能探索一种安全有效地治疗方法，以提高肿瘤治疗的效率。既然EGFR及其家族成员对肺癌的发生和发展十分重要，我们希望有更多的新的方式来干预这些靶点。理论上，只要设计合理，我们能通过泛素化作用降解任意的蛋白质，从而为肿瘤治疗提供新的思路。泛素化最早被描述成为细胞内清除短效的，受损的或者异常的蛋白的一种方式。然而，随着当今研究的进展，越来越多的发现证实泛素化参与细胞内更多的活动，其地位与磷酸化越来越相近。泛素化的过程就是泛素激活酶E1将活化的泛素分子转移到E2结合酶上，之后，泛素连接酶E3结合携带着泛素分子的泛素结合酶E2，通过连接酶E3的转移作用，泛素分子被转移到底物蛋白上，这整个过程就是泛素化修饰。最后经过泛素化修饰的蛋白质被运送到蛋白酶体，并被降解的过程。本研究通过构建能够靶向性识别和结合EGFR及其家族成员的受体型酪氨酸激酶结构域的重组泛素连接酶，利用具有泛素连接酶E3活性的Cbl的RING结构域和CHIP的U-box结构域行使泛素化、降解功能，通过泛素化作用，下调肿瘤细胞中EGFR的水平，最终实现抑制肿瘤的目的。这与传统的靶向治疗策略相比，此方法具有能够同时针对几个具有相同结合结构域的靶蛋白并直接降低其蛋白质水平的优势，同时泛素化能够有效避免靶蛋白发生继发突变而导致耐药。在利用泛素化靶向治疗肺癌的同时，我们期望能利用此种技术为肺癌患者提供更多的益处。晚期肺癌患者，一旦出现肺癌骨转移以后，疾病基本没有治愈的机会，为了提高患者生活质量，我们期望能用泛素化技术抑制转移瘤对骨的破坏。转移瘤对骨的溶骨性破坏一般由破骨细胞活性增强引起，而不是肿瘤细胞直接多骨组织的作用。在破骨细胞的活化过程中，RANKL-OPG-RANK信号通路发挥着关键的作用。在此信号通路中，RANKL有着共同的接头蛋白—TRAF家族蛋白，TRAF家族多个成员均以与TRIP(TRAF-interacting protein)结合。我们计划利用能与TRAF蛋白靶向结合的TRIP C端的coiled-coiled结构域构建泛素重组连接酶，靶向降解TRAF家族蛋白，从而抑制破骨细胞的活性，最终达到抑制骨破坏的作用，提高患者的生活质量。在本研究的第一部分实验中，我们通过重组PCR，将接头分子Shc、Grb2分别能够与磷酸化的EGFR结合的PTB结构域（Phosphotyrosine Binding domain）和SH2（Src-homology region2）结构域的基因以及TRIP C端的coiled-coiled结构域与CHIP的U-box结构域基因或者Cbl的RING（Y371E）结构域基因进行基因融合，将构建好的融合基因连接到真核表达载体pFLAG-CMV4里，构建具有目的特异性的重组泛素连接酶。接下来，在实验二中，我们首先筛选了最适宜的肺癌细胞系，并且检测了重组泛素连接酶在肺癌细胞系和293T细胞系中对靶蛋白的降解作用。在第三部分实验中，我们从功能角度检测了重组泛素连接酶对Spc-A1细胞系的恶性表性的影响。在实验四中，我们初步探讨了重组泛素连接酶对与肺癌骨转移的保护作用及其机制。实验一：设计引物，利用普通PCR分别扩增Shc的PTB结构域基因、Grb2的SH2结构域基因以及TRIP C端的coiled-coiled结构域、CHIP的U-box结构域基因和点突变Cbl的RING（Y371E）结构域基因，利用重组PCR将SH2、PTB以及TRIP与U-box、PTB与RING（Y371E）分别进行基因融合，获得的产物分别命名为SH2-RING（Y371E）、SH2-U-box和PTB-U-box以及TRIP-U-box。将融合基因产物双酶切处理，插入真核表达载体pFLAG-CMV4。经过酶切鉴定和测序验证，重组质粒构建成功。实验二：首先从肿瘤细胞转染效率和内源性EGFR表达量的角度筛选最合适的肺癌细胞系。分别用构建成功的重组泛素连接酶与EGFR质粒共转染293T细胞系，并用重组泛素连接酶转染EGFR高表达的肺癌细胞系，分别设立实验组，阴性对照组和空白对照组，检测重组泛素连接酶对靶蛋白水平的影响，结果显示三种重组泛素连接酶均能不同程度的降解靶蛋白。证明靶蛋白下降后，设计引物并进行Real-time PCR实验，检测重组泛素连接酶对靶蛋白的mRNA的影响，以证明重组泛素连接酶的干预作用是在翻译后水平。实验三：根据实验二的结果，进一步进行细胞学实验，分别设立实验组，阴性对照组和空白对照组，利用MTT比色实验、平板克隆形成实验以及Transwell实验检测重组泛素连接酶对肿瘤细胞的增殖能力和转移侵袭能力的影响；将重组质粒与多西他赛联合用药检测重组质粒对多西他赛的协同作用。结果显示，两种重组泛素连接酶能够明显的抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭能力，能显著促使肿瘤细胞凋亡。实验四：将构建成功的重组泛素连接酶与接头蛋白TRAF2、6共同转染293T细胞系，设立pFLAG-CMV4-TRIP-U-box为实验组，pFLAG-CMV4-TRIP为阴性对照组和空载体pFLAG-CMV4为对照，检测重组泛素连接酶对靶蛋白水平的影响，免疫印迹结果显示重组泛素连接酶pFLAG-CMV4-TRIP-U-box能促使靶蛋白表达下调。利用免疫共沉淀证实重组泛素连接酶pFLAG-CMV4-TRIP-U-box能够与TRAF6直接结合。直接证明了两者间的相互作用。综上所述，在多种肿瘤细胞中都存在RTK的异常活化和过度表达，靶向降解这些分子是行之有效的抑制肿瘤的方法。EGFR是RTK家族中的重要成员，参与肿瘤细胞的恶性转化。虽然目前针对EGFR的靶向治疗面对着耐药的巨大挑战，但是它们依旧是肿瘤治疗中的理想靶位。泛素化是一种常见的翻译后修饰方式，通过泛素化修饰介导蛋白质的泛素-蛋白酶体降解途径，理论上能够使任意底物蛋白发生降解。精心设计的重组泛素连接酶同时具有特异的靶向功能和高效的E3泛素连接酶的催化功能，从而达到对目标靶向降解的目的，是一种新型而有效的肿瘤治疗策略。