昆虫是地球上种类最多的动物群体,目前已报道的昆虫种类有100多万种,在生态系统上占据重要地位。在进化过程中,昆虫显然已经进化形成了一套高效的防御系统,用于抵御微生物的感染和寄生。除了保护色和机体物理屏障如角质表皮、鳞毛或甲壳外,昆虫还具有识别和清除体内异物的高效免疫分子。免疫系统研究是昆虫研究中最重要的基本问题之一,对于阐明生物的生长发育和起源进化具有重要意义。家蚕是典型的鳞翅目模式昆虫,也是一种完全依靠人类饲养才得以生存的重要经济昆虫,其基础研究有着良好的积累,并保存有大量的突变体及繁育系。对家蚕免疫相关基因的研究,不仅可以促进人们了解家蚕免疫应答的分子调控机制,也可以促进人们对昆虫的分子调控机制的理解,并为昆虫免疫分子的多样性研究提供线索。借鉴果蝇的免疫研究成果,利用家蚕基因组精细图、基因芯片和EST等多种家蚕的数据资源,通过生物信息学分析,我们对家蚕的免疫系统相关基因进行了鉴定,对一些关键基因进行了克隆,并对关键基因家族进行了比较和系统进化研究,重点探讨了它们的免疫诱导表达模式和功能,最后对家蚕免疫应答的分子机制进行探讨。获得的主要研究结果如下:1.家蚕的免疫系统相关基因采用果蝇和按蚊所有免疫相关基因在家蚕基因组中进行同源性分析的方法,鉴定家蚕的免疫系统相关基因。我们鉴定了家蚕21个基因家族的218个免疫相关基因,主要包括:(1)模式识别受体,如PGRP、GNBP、凝集素和清道夫受体等基因家族;(2)4个信号传导途径的相关基因:如Toll途径的Spz、Toll、MyD88、Pelle、Tube、TRAF2和Cactin,Imd途径的FADD、Dredd、TAK1、TAB、IKKβ、IKKγ和Relish,JAK/STAT途径的Domeless、Hopscotch和STAT;(3)7类抗菌肽家族的基因。其中,大约65%的基因具有EST表达证据;大约90%的基因已经定位到相应的染色体上,这为将来的基因功能研究提供了重要信息。系统进化分析发现家蚕的免疫相关基因在昆虫中都很保守。模式识别受体和抗菌肽基因则具有明显的物种特异性,在家蚕基因组中具有多个物种特异的拷贝,序列分化和物种特异的基因重复现象明显,暗示它们受到更小的环境选择压力。同时,发现45个家蚕—果蝇—按蚊—蜜蜂的1:1:1:1的直系同源基因,其中,信号传导途径的基因都显示1:1:1:1直系同源关系,推测家蚕拥有与果蝇等其它昆虫类似的免疫应答信号传导机制。2.基于全基因组芯片的免疫诱导表达谱分析本研究运用包含22987个基因探针的全基因组芯片,通过大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)和苏云金芽孢杆菌(革兰氏阳性细菌)诱导5龄第3天家蚕幼虫,在4个时间点对脂肪体进行了转录组比较分析。芯片扫描结果显示,总共有9961个探针有表达信号(信号值＞400),占总探针数的43.3%,与此前的组织芯片结果相似。采用ratio＞2倍的标准筛选差异表达基因,我们获得了210个上调表达的基因和200个下调表达的基因。通过基因功能分类,结果显示上调表达的基因主要是免疫应答相关基因,包括模式识别受体、抗菌肽基因、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂相关基因、黑化级联相关基因和调控铁元素代谢的基因等。而下调表达的基因主要是一些能量代谢和生化酶类基因,包括细胞色素P450超家族的基因、表皮蛋白基因、低密度脂蛋白、激素相关基因、动力相关蛋白编码基因,以及与常规代谢有关的酶基因等。这种表达模式反映了昆虫脂肪体组织作为免疫应答器官的生理特征。通过比较抗菌肽基因attacin、enbocin、cecropin、moricin、lebocin和gloverin等的诱导表达模式,发现在大肠杆菌诱导后抗菌肽基因诱导表达比苏云金芽孢杆菌更迅速,前者在诱导的前2小时的诱导水平明显更高,但是后者诱导表达的最大峰值却比前者明显更高。例如,enbocinl在苏云金芽孢杆菌诱导12小时后达到99.49倍,比大肠杆菌的同一时间点高了近一倍;Attacin在苏云金芽孢杆菌诱导12小时后也达到93.55倍,比大肠杆菌的高了4倍。由此推测家蚕对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的免疫应答具有细微差异。但总体上,比较大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的诱导芯片结果,发现两种细菌诱导后的上调表达基因和下调表达基因非常相似,并没有发现各自的特异表达基因,暗示了家蚕针对革兰氏阴性和阳性细菌具有相似的免疫应答机制。3.家蚕的Toll相关受体基因家族Toll受体在先天免疫和发育中有重要作用,它们含有胞外亮氨酸富集结构域和胞内的TIR结构域,在昆虫和脊椎动物中都非常保守。通过与果蝇的Toll受体比较,发现家蚕基因组中含有13个Toll样受体,分别命名为BmToll、BmToll-2到11、BmToLK-1和BmToLK-2。染色体定位显示有8个成员位于第23号染色体上,其中BmToll、BmToll-2和BmToll-7是家蚕特有的亚群。系统进化分析发现,家蚕的Toll受体与其它昆虫的基因明显形成7个进化亚群,其中,BmToll-6、BmToll-8和BmToll-9与果蝇和按蚊的基因呈明显的直系同源关系。通过组织和发育时期的基因芯片数据分析,结果表明BmToll和BmToll-2在卵巢中富集表达,暗示其可能在胚胎发生中起重要作用;而BmToll-2和BmToll-4在幼虫的中肠富集表达,推测它们可能参与免疫防御。另外,BmToll-10和BmToll-11和BmToLK-2在精巢特异表达暗示它们可能与性别特异的生物学功能有关。同时,我们采用RT-PCR技术检测了10个Toll基因在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白僵菌诱导下的表达谱,结果显示绝大多数基因存在表达差异。如在注射大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的样品中BmToll的表达明显被抑制;而BmToll-2则是在注射大肠杆菌和白僵菌的样品中表达量明显下调。相反,BmToll-3的表达量在三组诱导样品中都明显上调。家蚕Toll受体的鉴定和表达谱分析,将为我们研究Toll相关受体的生物学功能和Toll信号传导途径的分子机制提供帮助。4.家蚕的抗菌肽基因家族通过与已报道的昆虫抗菌肽的同源性分析,我们发现家蚕基因组总共包含有39个抗菌肽基因,包括12个Moricins、12个Cecropins、7个Gloverins、3个Attacins、2个Lebocins、2个Enbocins和1个Defensin。其中,Moricin和Gloverin为鳞翅目昆虫特有的抗菌肽基因家族,并且成簇分布在基因组上。序列相似性和染色体定位信息表明,家蚕的抗菌肽基因是由祖先基因经历了多次复制产生的基因家族。而这种物种特异的基因复制现象有可能反映了抗菌肽基因在免疫系统中起着非常关键的作用,因而产生多个基因拷贝以抵御不同的病原微生物。抗菌肽基因上游调控区的NF-kB/Rel和GATA转录因子结合元件对基因的表达起关键作用。在进化过程中,抗菌基因的上游调控序列同样经受进化选择。对29个家蚕抗菌肽基因的上游序列进行分析,鉴定出了kB-like、GATA、R1和CATT等基序簇。Cecropin和Moricin家族成员之间的上游调控序列的差异非常大,NF-kB样元件和GATA基序数目和位置都明显不同。而Gloverin家族成员之间的上游调控序列的变异较小,在距离转录起始位点附近都含有一个NF-kB样元件、一个GATA基序和一个R1基序。序列比较分析发现,Moricin和Cecropin基因家族的kB-like共有序列有明显不同的3末端序列,分别为GGKWNNRRNR和GGRRANYMMC。为了检测这些抗菌肽基因的诱导表达情况,我们用从细菌中分离的脂多糖作为诱导源,注射家蚕五龄幼虫,采用RT-PCR分析结果显示Cecropin和Gloverin两个家族的基因在诱导后高量表达,而Moricin B亚族的基因没有检测到表达。即使是在同一家族内,不同的基因之间在表达量和表达时期上也不尽相同。如Cecropin E基因的表达量明显比其它Cecropin基因低,表达的最高峰出现也比其它基因晚。结合这些基因的上游调控领域序列特征,推测免疫诱导活性差异与调控元件NF-kB-like、GATA位点数目的多少和这些调控元件与转录起始位点距离远近密切相关。另外,attacin和两个enbocin基因都可以被LPS诱导,但是表达量明显比Cecropin和Gloverin家族低,与细菌诱导芯片结果并不一致。这两个基因在两种细菌诱导后的表达变化水平明显高于其它基因,推测家蚕对LPS和细菌的识别机制可能有所差异。5.家蚕抗菌肽基因的系统进化和诱导表达模式家蚕基因组包含了比其它昆虫更多的抗菌肽基因,其中Moricin、Cecropin和Gloverin等三个基因家族都含有多个拷贝。通过计算编码序列的同义突变和非同义突变,发现这些基因家族的同义突变/非同义突变(d_N/ds)都小于1,分别为0.637、0.487和0.202,并且信号肽的比值比成熟肽的比值明显更大,暗示了成熟肽趋于更强的稳定性选择。在这三个家族中,受到的进化负选择压力大小关系为Moricin＜Cecropin＜Gloverin。结合抗菌谱和诱导表达活性的差异分析,发现选择压力小的Moricin和Cecropin家族成员之间的抗菌谱和诱导表达活性的差异明显比Gloverin家族的更大。二级和三级结构预测显示,Moricin和Cecropin家族都由α-螺旋组成,而正选择位点也主要位于该区域。通过家蚕抗菌肽的抗菌活性和诱导表达差异与序列差异的关联分析,我们可以得出如下推论:家蚕抗菌肽基因家族可能存在主要抗菌功能基因的强免疫诱导模式。家蚕的抗菌肽Moricin、Cecropin和Gloverin基因可能通过不等交换产生多拷贝基因家族。并且在与微生物的协同进化过程中,抗菌肽基因的编码序列受到不同的选择压力,导致部分氨基酸的改变,从而改变抗菌肽的分子结构和相应的静电势。这些变化最终导致抗菌肽家族成员间的抗菌谱和抗菌活性的差异。例如,Cecropin家族和鳞翅目特异的Moricin家族是由序列差异导致抗菌活性和诱导表达差异的典型家族,BmcecB1、BmcecD和BmmorA1等三个基因都具有高抗菌活性和高诱导表达的特点,推测它们可能承担了主要的抗菌功能,其它成员可能具有协同抗菌功能。而鳞翅目特异的Gloverin家族的序列分化比前两个家族小,功能上的分化也不如它们明显,并不完全符合高抗菌活性和高诱导表达的规律。例如,BmglvA2符合高抗菌活性和高诱导表达的规律,而BmglvB具有较高的抗菌活性,但是诱导表达水平却相对最低。家蚕抗菌基因家族的这种特征可能为基因家族的分子进化以及功能分化的理解和由复制而来的新基因的命运提供了一个很好的研究模式。6.家蚕抗菌肽基因表达的调控网络综合上述分析,我们初步提出家蚕的抗菌肽基因表达调控网络,其步骤大致可分为4个:首先,家蚕在受到细菌感染时,模式识别受体PGRPs和GNBPs对感染信号进行识别,并通过胞外的丝氨酸蛋白酶级联激活家蚕的Sp(?)itzle基因。其次,活化的Sp(?)tzle基因激活Toll受体,或者通过PGRP长型受体激活胞内的Imd蛋白,把细胞外的感染信号传递到胞内。再次,通过胞内信号级联反应,激活家蚕的NF-kB类转录调控因子BmRel或BmRelish。最后,激活的转录因子进入细胞核,与抗菌肽基因的上游调控序列结合,高效启动家蚕的抗菌肽基因表达。