早发性卵巢功能不全是女性在40岁之前因卵巢功能缺失导致的一种临床综合征,以高水平的促性腺激素和低水平的雌激素引起的月经紊乱为临床特点。目前大多数针对早发性卵巢功能不全的替代性和互补性治疗方案,疗效是有限的,缺乏安全性方面的数据,因此,探索可替代的安全有效的针对早发性卵巢功能不全的治疗方案具有非常重要的临床意义。近年来,随着我国中医药事业的蓬勃发展及对早发性卵巢功能不全认识的不断深入,中医药治疗该病的临床及实验研究取得了一定进展。本研究中的“护阳养坤方”是导师根据女性生殖周期衰退规律、三阴三阳开阖枢理论及刘完素“天癸已绝,乃属太阴经也”的理论,结合多年临床实践经验,总结而成的经验方。护阳养坤方缓解POI患者的临床症状、调节激素水平、复苏残余卵泡及恢复月经周期等疗效在临床研究中已经得到证实,而本方治疗POI的调控机理目前尚未明了。基于护阳养坤方良好的临床疗效及前期的临床研究,为更加完善护阳养坤方治疗早发性卵巢功能不全的机制,本研究将进一步从转录组学角度分析护阳养坤方潜在作用机制,以期为护阳养坤方提高卵巢功能提供实验依据。目的:1.通过实验研究,观察护阳养坤方对POI大鼠卵巢功能的影响,初步评价其安全性。2.运用转录组测序技术对大鼠卵巢基因进行检测,筛选出显著富集的差异表达基因及信号通路。3.使用Real Time PCR对信号通路上的关键基因进行验证,探讨护阳养坤方治疗POI的可能作用机制。方法:1.护阳养坤方对POI大鼠的药效研究选取44只健康雌性SD大鼠按3:1比例随机分为2组,VCD建模组33只,空白对照组11只。VCD建模组每天腹腔注射VCD溶液160mg/Kg,每天1次,连续注射15天,建立POI大鼠模型。空白对照组每天腹腔注射同等剂量芝麻油,每天1次,连续注射15天。VCD造模结束后第10天,选取造模成功SD大鼠27只,随机分为3组,每组9只,分为VCD模型组、护阳养坤方低剂量组、护阳养坤方高剂量组;同时随机选取9只仅腹腔注射芝麻香油的SD大鼠为空白对照组。护阳养坤方低剂量组给予中药灌胃0.135g/kg,分2次量,每天2次,共25天;护阳养坤方高剂量组给予中药灌胃0.235g/kg,分2次量,每天2次,共25天;VCD模型组和空白对照组灌服等容量生理盐水,每天2次,共25天。观察大鼠的一般情况,包括饮食饮水、体重、二便、精神状态、生存情况、活动能力及毛发色泽等;同时取阴道脱落细胞涂片检查,观察各组大鼠动情周期变化,将大鼠麻醉取材后,采用酶联免疫法检测E2、FSH、AMH、ALT、AST、BUN、Cr,观察卵巢组织形态学的变化并对各级卵泡计数。2.护阳养坤方对POI大鼠的转录组学研究取出“护阳养坤方对POI大鼠的药效研究”中保存的大鼠卵巢组织,空白对照组、VCD模型组、护阳养坤方低剂量组、护阳养坤方高剂量组每组随机选取3个卵巢样本提取RNA并进行质量检测,构建测序文库,完成转录本组装及合并,筛选出差异表达基因,对差异表达基因进行GO功能及KEGG功能分析,筛选出显著富集的差异表达基因及信号通路。3.护阳养坤方对MAPK和NF-kB信号通路的影响筛选护阳养坤方治疗POI相关信号通路中关键基因,用Real Time PCR对筛选的通路中关键基因进行验证,结合前期实验与文献资料分析护阳养坤方治疗POI的作用机制。结果:1.护阳养坤方对POI大鼠的药效研究(1)大鼠的一般情况:与空白对照组比较,VCD模型组毛发僵硬稀疏、无光泽,反应迟钝、蜷卧、互相追逐、撕咬或萎靡,行为活动减弱,摄食饮水减少,大便质硬;与VCD模型组比较,给中药组大鼠脱毛逐渐减少,反应逐渐灵敏,行为活动恢复正常,摄食量逐渐增大。(2)卵巢病理变化:与空白对照组比较,VCD模型组卵巢体积萎缩,各级卵泡结构不完整或消失,成熟卵泡与窦卵泡数量明显减少,发育卵泡直径小且数量变少,颗粒细胞排列紊乱且层数减少,细胞核固缩,闭锁卵泡增多,黄体极少见,间质血管较少,可见纤维化增生及炎细胞浸润,髓质致密;与VCD模型组比较,给中药组大鼠各级卵泡发育程度较好,卵泡数量增多,窦卵泡和成熟卵泡数量未见明显减少,颗粒细胞排列稍整齐且层数增多,闭锁卵泡数量稍有减少。(3)卵巢内各级卵泡计数比较:与空白对照组比较,VCD模型组各级发育卵泡数目百分比下降,闭锁卵泡数目百分比升高;与VCD模型组相比,给中药组大鼠各级发育卵泡数目百分比增加,闭锁卵泡数目百分比减少。(4)大鼠激素水平比较:与空白对照组比较,VCD模型组大鼠E2和AMH水平下降,FSH水平升高;与VCD模型组比较,给中药组大鼠E2和AMH水平呈升高趋势,FSH水平呈下降趋势。(5)安全性指标评估:与空白对照组比较,VCD模型组、护阳养坤方低剂量组、护阳养坤方高剂量组ALT、AST、BUN、Cr水平差异均无统计学意义。2.护阳养坤方对POI大鼠的转录组学研究(1)转录组测序质量评估:四组大鼠卵巢测序文库原始reads中高质量reads均在98%以上,Q20的碱基比例均在95%左右,过滤前后碱基组成均良好,测序量均达到饱和标准,样品mRNA打断的随机程度均一般,组内重复性检验皮尔逊相关系数均接近1。(2)比对SD大鼠参考基因组:四组样品中单一比对上SD大鼠参考基因组的reads均占总reads的80%左右,未比对上参考基因的reads占的比例较小。(3)基因统计结果:空白对照组、VCD模型组、护阳养坤方低剂量组、护阳养坤方高剂量组样品检测到的己知基因数的百分比分别为76.09%、76.19%、76.25%、75.30%,四组大鼠样品的基因覆盖度良好,且基因表达丰度有差异。(4)成对差异基因统计结果:空白对照组和VCD模型组,VCD模型组和护阳养坤方低剂量组,VCD模型组和护阳养坤方高剂量组差异基因比较总计分别有17个(上调基因5个、下调基因12个),52个(上调基因35个、下调基因17个),72个(上调基因19个、下调基因53个)差异基因。(5)差异基因KEGG Pathway富集分析:显著表达基因主要涉及26条信号通路,其中MAPK信号通路,PI3K-Akt信号通路,JAK信号通路,Toll样受体信号通路,NF-kB信号通路,AMPK信号通路,RIG-I样受体信号通路显著富集。3.护阳养坤方对MAPK和NF-kB信号通路的影响(1)护阳养坤方对MAPK信号通路的影响:共有5个差异基因富集到MAPK信号通路中,共有3个差异基因富集到NF-kB信号通路中。(2)RT-PCR验证结果显示护阳养坤方通过调控CIS、SOCS、TAK1、JAK、MAP2K4、MYD88、TLR5、MAPKK3基因的表达,影响MAPK信号通路、NF-kB信号通路活性。结论:1.VCD能成功构建POI动物模型,选择性破坏原始卵泡和窦前卵泡,可能通过细胞凋亡途径导致POI的发生。2.护阳养坤方可以改善POI大鼠的一般状况,调节大鼠性激素水平,改善POI大鼠的卵巢组织结构,增加发育卵泡数目比例,减少闭锁卵泡数目比例,且安全性好。3.与护阳养坤方治疗POI大鼠相关的信号通路主要包括MAPK信号通路,PI3K-Akt信号通路,JAK信号通路,Toll样受体信号通路,NF-kB信号通路,AMPK信号通路,RIG-I样受体信号通路。4.护阳养坤方可能通过调节NF-kB信号通路及MAPK信号通路中CIS、SOCS、TAKI、JAK、MAP2K4、MYD88、TLR5、MAPKK3基因的表达,改善POI大鼠的卵巢功能。