论文部分内容阅读
背景急性髓系白血病（AML）是一种来源于髓系祖细胞的恶性肿瘤,侵袭性高且预后较差。多数AML患者的病因不明,其危险因素包括年龄较大、接触化学品以及骨髓增生异常综合征等。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase,BTK）和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱγ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase,Ca MKⅡγ)是AML发病过程中的重要促癌因子,依鲁替尼（Ibrutinib）可通过抑制酪氨酸激酶从而阻断AML细胞的增殖和迁移,小檗胺（Berbamine,BBM）是Ca MKⅡ的天然抑制剂药物,能与Ca MKⅡγ竞争性的与ATP相结合,从而抑制白血病细胞的增殖并促进分化。联合用药广泛用于治疗包括癌症在内的多种疾病,本研究尝试将小檗胺和依鲁替尼联合用药,初步探索其联合作用机制,为开发AML的新疗法提供理论和实验依据。目的明确小檗胺与依鲁替尼两药联合对急性髓细胞白血病细胞增殖、凋亡和周期的影响,并初步探索其联合作用机制。方法使用依鲁替尼（0、0.5、1.0、2.0μmol/L）和小檗胺（0、20、40、80μmol/L）分别作用于AML细胞系KG-1、MOLM13、KG-1a和THP-1,CCK法检测细胞存活率,并计算的半抑制浓度IC50（Half maximal inhibitory concentration）。按照IC50（小檗胺）与IC50（依鲁替尼）的摩尔浓度比值进行联合用药培养48h后,比较单药与双药作用后细胞的存活率,并利用Calcusyn软件计算联合指数CI（combination index）。使用IC50浓度配比处理48h后,用流式细胞仪比较单药组与联合组细胞的凋亡比例,Western Blot检测凋亡蛋白（PARP、Caspase9和Cleaved-caspase3）的表达量。使用1/2×IC50浓度配比处理24h后,用流式细胞仪比较单药组与联合组细胞的细胞周期。使用生物信息的方法验证BTK在AML患者中的表达差异以及与AML患者预后的关系,GO和KEGG富集分析了BTK相关的信号分子通路。Western Blot验证BTK相关分子蛋白（P-BTK、P-AKT、CREB、GSK3β和BCL-XL）的表达量。结果联合组细胞活力明显降低（P＜0.05）,ED50/ED75/ED90的联合指数均小于1。流式细胞仪检测发现,联合组细胞凋亡率分别为KG-1:98.9%,MOLM-13:40.8%,单药组的细胞凋亡率分别为小檗胺（KG-1:45.8%,MOLM-13:6.06%）和依鲁替尼（KG-1:2.70%,MOLM-13:6.11%）,联合组细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。联合组G0/G1期细胞比率分别为KG-1:47.57%,MOLM-13:78.59%,而单药组G0/G1期细胞比率分别为小檗胺（KG-1:38.70%,MOLM-13:47.95%）和依鲁替尼（KG-1:38.51%,MOLM-13:63.64%）,联合组G0/G1期细胞比例较单药组明显升高（P＜0.05）。生物信息学分析发现BTK在AML患者中呈现异常高表达,且与AML患者的OS缩短显著相关（P＜0.05）。GO和KEGG基因富集分析发现BTK与ECM受体的相互作用、PI3K-AKT信号途径以及B细胞受体信号途径等多个通路密切相关。Western Blot检测发现联合组凋亡蛋白（PARP、Caspase9和Cleaved-caspase3）的表达显著上调（P＜0.05）,而P-BTK、P-AKT、CREB、GSK3β和BCL-XL的表达明显下调（P＜0.05）。结论小檗胺与依鲁替尼在抑制AML细胞增殖和促进调亡方面具有协同作用,并阻滞AML的细胞周期。BTK在AML患者体内呈现异常高表达,与PI3K-AKT信号途径等信号通路密切相关。小檗胺联合依鲁替尼可通过P-BTK/P-AKT/CREB和GSK3β/BCL-XL信号通路发挥抗AML细胞的协同作用。