在本实验室近期系列鸡锰营养研究成果的基础上,本论文采用Caco-2细胞模型进行四个试验,研究Caco-2细胞对不同络合强度有机锰与无机锰的吸收特点及差异,并进一步探讨其吸收的分子机制。试验一首先构建Caco-2体外细胞模型,将Caco-2细胞接种于Transwell细胞转运培养槽的聚碳酸酯微孔滤膜上,在37℃C和5%CO2浓度培养条件下培养21d,细胞跨膜电阻值达到659Ω·cm2,肠腔侧(AP)碱性磷酸酶活性显著高于基底侧(BL)酶活性(P<0.01)。表明本实验室构建的Caco-2细胞模型在形态上与小肠上皮细胞相似,细胞已产生极性,且细胞间已形成紧密连接,可作为小肠吸收的体外模型。试验二采用Caco-2细胞模型研究无机锰的吸收特点,共包括2个试验。试验1研究无机硫酸锰在Caco-2细胞中吸收随时间变化的规律,根据锰的吸收转运与孵育时间的曲线关系,在二者的线性范围内确定细胞最佳孵育时间,为在细胞最敏感状态下研究锰的吸收提供试验依据。采用单因子完全随机试验设计。设细胞孵育时间分别为0、10、20、40、60、80、100和120min共8个处理组。每个处理6个重复,分别研究不同时间点无机锰从AP-BL及BL-AP的吸收转运,两个方向的吸收转运共用一个不加锰的空白对照。根据本实验室28日龄AA肉鸡食糜上清中锰实际测定值(146在添加锰的细胞培养液中以硫酸锰形式添加锰146结果表明,Caco-2细胞从AP-BL和BL-AP两个方向对无机锰的吸收随孵育时间的增加呈线性增加,而细胞AP侧和BL侧对锰的摄取随时间的变化呈渐近线趋势。根据AP-BL和BL-AP侧吸收量数据,Caco-2细胞在40分钟时两个方向的吸收量相当(3.63nmol/cm2vs3.67nmol/cm2),预示细胞在该时间点达到平衡,之后进入稳定吸收阶段。故选取40和120mmin两个时间点研究Caco-2细胞对无机锰的吸收动力学。试验2在试验1确定的最佳孵育时间的基础上,研究无机锰在Caco-2细胞中的吸收动力学特点,并通过二价金属转运蛋白1(DMT1)和膜铁转运蛋白(FPN1) mRNA的表达来研究其在Caco-2细胞顶膜锰摄取和基底膜锰转运中的作用。采用单因子的完全随机试验设计,共设10个锰浓度处理组,分别为0、25、50、100、200、500、1000、1500、2000和2500чmol/L,每个处理6个重复。设40和120min两个细胞孵育时间点,研究无机锰从AP-BL的吸收转运特点。结果表明,在细胞孵育40和120min,无机锰浓度为25-1000μmol/L时,Caco-2细胞对锰以饱和载体方式进行吸收；锰浓度在1000~2500чmol/L持续升高,Caco-2细胞对锰的吸收呈简单扩散形式吸收。细胞孵育40min时,Caco-2细胞锰载体转运系统对无机硫酸锰的最大吸收速率Jmax高于120min的Jmax (13.3nmol/cm2/hvs10.1nmol/cm2/h)(P<0.05);二者的Km值接近(194чmol/L vs192чmol/L)(P>0.23)。Caco-2细胞中锰转运载体的表达表明,800чmol/L锰处理组顶膜DMT1mRNA水平显著低于空白对照组(P<0.01),基底膜FPN1mRNA水平与对照组相比则显著提高(P<0.01)。提示DMT1和FPNl可能参与Caco-2细胞顶膜锰的摄取和基底膜锰的转运。试验三研究弱、中等、强络合强度有机锰和无机锰在Caco-2细胞中的吸收、摄取及转运(吸收+摄取)的动力学特点,以了解有机锰和无机锰在Caco-2细胞中吸收特点的差异。采用4(锰源)×6(锰添加水平)+1(不添加锰对照)两因子的完全随机试验设计,细胞孵育液中添加的4种锰源分别为无机硫酸锰、弱络合强度氨基酸锰(Qf=2.35,锰含量为7.5%)、中等络合强度复合氨基酸锰(Qf=16.85,锰含量为9.06%)和强络合强度锰蛋白盐(Qf=186,锰含量为10.18%)。细胞孵育液中添加锰的浓度分别为50、100、200、400、800和1600чmol/L,同时设置不添加锰对照组。共25个处理,每个处理6个重复。细胞孵育时间为120min。试验结果表明,随着锰添加浓度的升高,各锰源处理组在Caco-2细胞中的锰吸收量均显著增加(P<0.001)。当锰添加浓度为400、800和1600чmol/L时,弱、中等和强络合强度有机锰的锰吸收量分别显著高于无机硫酸锰组(P<0.01)。有机锰各处理组相比,随着络合强度增加,锰吸收量逐渐增加,且以强络合强度有机锰的锰吸收量最高。不同形态锰在Caco-2细胞中的吸收都最适合饱和载体转运模型,弱、中等和强络合强度有机锰在Caco-2细胞中的吸收动力学参数Jmax和Km均显著高于无机硫酸锰(P<0.01)；有机锰的Jmax值有随着络合强度增加而升高的趋势,且强络合强度有机锰的Jmax值显著高于弱络合强度有机锰(P<0.05),而其他有机锰处理组Jmax值相互间无显著差异(P>0.05)。对于Km值,三种有机锰处理组之间均无显著差异(P>0.05)。不同形态锰在Caco-2细胞中的摄取结果表明：处理液中添加低浓度锰(50～200μmol/L)时,Caco-2细胞对有机锰和无机锰的摄取量无显著差异(P>0.05)；当处理液中锰浓度为400、800和1600μmo1/L时,Caco-2细胞对弱、中等和强络合强度有机锰的摄取量显著高于无机硫酸锰组(P<0.01),而三种有机锰源间锰摄取量均无显著差异(P>0.05)。Caco-2细胞顶膜对不同形态锰的摄取动力学模型均最适合饱和载体模型,有机锰的摄取动力学参数Jmax和Km均显著高于无机硫酸锰(P<0.01)；有机锰组的Jmax值表现出弱>强>中等络合强度有机锰的趋势,但三者之间无显著差异(P>0.05)。弱和强络合强度有机锰的Km值显著高于中等络合强度有机锰(P<0.05)。以上试验结果表明,不同形态锰在Caco-2细胞顶膜均以饱和载体方式进行摄取,且位于Caco-2细胞顶膜的锰载体转运系统对弱、中等和强络合强度有机锰的摄取能力高于无机硫酸锰。不同形态锰在Caco-2细胞中的转运(吸收+摄取)结果表明,当处理液中锰浓度为50～100чmol/L时,不同形态锰在Caco-2细胞中的转运均无显著差异(P>0.05)；当锰浓度为400-1600чmol/L时,Caco-2细胞对弱、中、强三种有机锰源的转运均显著高于无机硫酸锰(P<0.01),且随络合强度增加,锰的转运逐渐增加。曲线拟合结果表明,不同形态锰在Caco-2细胞中的转运均最适合饱和载体模型,Caco-2细胞对有机锰转运的Jmax和K。均显著高于无机硫酸锰(P<0.01)。该结果再次提示,不同形态锰在Caco-2细胞中的吸收是由不同的载体转运系统参与完成的。试验四在近期肉鸡不同形态锰吸收利用系列最新研究结果和本论文试验三Caco-2细胞对不同形态锰吸收转运结果的基础上,通过不同形态锰对Caco-2细胞锰转运载体DMT、FPN1及中性(B0T1、LAT2)、碱性(rBAT、 y+LAT1)和酸性(EAAT3)氨基酸转运载体mRNA水平的影响,揭示不同形态锰吸收差异的分子机制。试验采用4(锰源)×2(锰添加水平)+1(不加锰对照)两因子的完全随机试验设计,细胞孵育液中添加的4种锰源分别为无机硫酸锰、弱络合强度氨基酸锰(Qf=2.35,锰含量为7.5%)、中等络合强度复合氨基酸锰(Qf=16.85,锰含量为9.06%)和强络合强度锰蛋白盐(Qf=146,锰含量为10.18%)。细胞孵育液中添加锰浓度分别为400和800чmol/L,同时设置不添加锰对照组。共9个处理,每个处理6个重复。细胞孵育时间为120min。上述400和800чmol/L锰处理组用以再次研究不同形态锰的吸收,而400чmol/L锰处理组用以检测上述转运载体mRNA的表达水平。结果表明,(1)锰浓度为400和800чmol/L时,有机锰的吸收量显著高于无机锰(P<0.01),且表现为随着络合强度增加,锰的吸收量增加,以强络合强度有机锰的吸收最高的趋势。(2)添加400μmol/L不同形态锰分别下调了Caco-2细胞顶膜DMT1、BOAT1、rBAT和EAAT3mRNA的表达,上调了基底膜FPN1、y+LAT1和LAT2mRNA的表达；与无机锰处理组相比,弱、中等和强络合强度有机锰均显著上调DMT1、rBAT、 EAAT3、FPN1、BOAT1、y+LAT1和LAT2mRNA的表达。综上所述,当锰浓度在25~1000чmol/L时,无机锰在Caco-2细胞中以饱和载体转运方式吸收,当锰浓度在1000~2500чmol/L持续升高时,锰在Caco-2细胞中的吸收呈非饱和扩散型。DMTl和FPN1可能参与细胞顶膜无机锰的摄取和基底膜锰的排出。不同形态锰在Caco-2细胞中主要以饱和载体转运方式吸收转运,有机锰的吸收、转运均高于无机硫酸锰,且随着络合强度增加,锰的吸收、转运量均逐渐增加。弱、中等和强络合强度有机锰组DMT1, FPN1、B0T1、LAT2、rBAT、 y+LAT1和EAAT3mRNA水平均明显高于无机锰组,可能是造成有机锰的吸收高于无机锰的原因。以上研究成果,初步揭示了不同形态锰在细胞水平吸收的分子机制,为进一步研究上述转运载体在不同形态锰吸收中的作用从而深入揭示锰吸收的分子机制奠定基础。