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人参是最著名的中草药之一,其主要的活性成分是人参皂苷。天然含量高的人参皂苷活性低、人体吸收率低。为了得到高活性人参皂苷,本论文针对人参三醇类皂苷的生物转化,研究了人参皂苷酶Ⅳ型的微生物发酵产酶、酶的分离纯化和酶的催化特性以及酶转化产品的制备。以三七根为原料,用甲醇浸提法提取了总皂苷,醇提物经脱脂、水饱和正丁醇萃取、硅胶层析分离后,制备了高纯度的三醇类皂苷Rgl和R1。Rg1纯度为98.4%,得率为3.17%；R1纯度为96.7%,得率为0.48%；为本实验准备了酶反应底物。筛选了产人参三醇类皂苷糖苷酶效果较好的Aspergillus sp.39g菌。该菌最佳发酵产酶条件是：以含1%的人参水提物(诱导物)的5%麦芽汁为培养基,在30℃发酵4天。对其培养液去除菌体、浓缩后,用DEAE离子交换层析法和凝胶电泳法分离纯化,得到纯酶。用SDS-PAGE法测得酶的分子量为约56kDa。酶反应最适pH为6.0,最适温度为40℃；在pH3.0-7.0的范围内、60℃以下稳定。K+、Na+、Zn2+和Ca2+4种离子对酶的活力几乎没有影响,而Mg2+离子对酶活力有微弱的促进作用,Cu2+和Fe2+抑制酶活力。提纯的酶能水解多种三醇类皂苷6-O-上的多种糖基,即它能水解Re上的6-O-α-L-(1→2)-鼠李糖基、R1上的6-O-β-D-(1→2)-木糖基生成Rg1,然后进一步水解Rg1上的6-O-β-D-葡萄糖基,生成F1；能水解Rg2(S)上的6-O-α-L-(1→2)-鼠李糖基、Rf(S)上的6-O-β-D-(1→2)-葡萄糖基,生成Rh1(S),然后进一步水解Rh1(S)上的6-O-β-D-葡萄糖苷键,生成昔元；但是不能水解二醇类皂苷例如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2上3-O-或20-O-上的糖基,不能水解多数糖苷酶底物对硝基苯基的多种糖基,但能水解对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(pNP-β-D-Gal)。该酶能水解多种三醇类皂苷6-O-上的多种糖基,不同于国际酶学委员会公布的184种糖苷酶(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/,一种糖苷酶只能水解一种糖苷键),是新型酶；也不同于水解人参二醇类皂苷的3-O-和20-O-多种糖基的人参皂苷酶Ⅰ型、Ⅱ和Ⅲ型,将其命名为人参皂苷糖苷酶Ⅳ型。研究了人参皂苷酶Ⅳ型水解各三醇皂苷底物的动力学。Re与R1结构相似,苷元相同,含三个糖基,只是6-O-的糖基不同,Re的6-O-糖链末端糖基为鼠李糖,而R1的6-O-糖链末端糖基为木糖；酶水解Re鼠李糖基的Km=22.2mM,Vmax=7.94mM/h,水解R1木糖基的Km=7.06mM,Vmax=1.61mM/H;在5mM浓度时,水解Re的鼠李糖基速度为1.46mM/h,水解R1的木糖基速度为0.67mM/h；因此该酶水解Re的鼠李糖基速度高于水解R1的木糖基速度。Rg1在20-O-和6-O-上各连有一个葡萄糖基,酶水解Rg1上6-O-葡萄糖基的Km=7.63mM,Vmax=0.125mM/h,在5mM的水解速度为0.05mM/h,说明该酶水解苷元上的6-O-葡萄糖基速度很慢。Rg2(S)与Rf(S)结构相似,与Re和R1的不同点为20-O-上没有糖基；Rg2(S)的6-O-糖链末端糖基为鼠李糖,而Rf(S)的6-O-糖链末端糖基为葡萄糖；酶水解Rg2(S)上6-O-α--L-(1→2)-鼠李糖基的Km=5.74mM,Vmax=9.43mM/h,水解Rf(S)上6-O-a-L-(1→2)-葡萄糖基的Km=5.74mM,Vmax=9.43mM/h,在5mM浓度时,水解Rg2(S)的速度为1.26mM/h,水解Rf(S)的速度为0.98mM/h；该酶更容易水解鼠李糖基。总之,人参皂苷酶Ⅳ型水解糖基的速度为：Re上的鼠李糖基>Rg2(S)上的鼠李糖基>Rf(S)上的葡糖糖基>R1上的木糖基>Rgl上直接连在苷元上的葡萄糖基。用人参皂苷糖苷酶Ⅳ型转化人参三醇皂苷Re和Rg1的混合物制备高活性F1单体皂苷。在pH6.0、40℃、底物反应浓度2.5%的条件下,反应24h,回收酶,上清经大孔吸附树脂脱糖、离子交换树脂脱色后,得到F1和Rg1粗品,得率57.6%。采用硅胶柱层析法对粗产物进一步纯化,得到纯度为98.2%的皂苷F1和纯度为96.1%的皂苷Rg1。本文发现了人参皂苷糖苷酶Ⅳ型,为酶法改变三醇类皂苷制备高活性皂苷提供了依据。