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目的:探讨氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)与HCV NS5A蛋白反式调节蛋白13(HCV NS5A trans-regulated protein 13,NS5ATP13)之间的关系及对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞增殖凋亡的影响及其作用机制。方法:1.观察并探讨OMT对HepG2细胞增殖凋亡的影响:(1)在HepG2细胞中加入不同浓度的OMT,干预HepG2细胞24h后,通过CCK-8检测浓度梯度下HepG2细胞活性变化,筛选出后续实验最适OMT药物浓度;(2)在HepG2细胞中加入适量OMT,检测细胞活力的变化、愈合速度、迁移及侵袭程度、Caspase-3/7表达水平变化,分析OMT对HepG2细胞增殖迁移的影响;(3)应用Western blot方法分析OMT对增殖凋亡相关基因Bcl-2、Bax、N-Cadherin表达的影响,初步探索OMT作用的机制。2.观察并探讨NS5ATP13对HepG2细胞增殖凋亡的影响:(1)在HepG2细胞中分别转染NS5ATP13过表达载体(pNS5ATP13)和小干扰RNA(siNS5ATP13)及各自的阴性对照等,利用瞬时转染技术,构建NS5ATP13基因的过表达与干扰的体外细胞模型,并在mRNA水平进行验证;(2)在验证成功的前提下,进一步检测过表达与沉默NS5ATP13后,HepG2细胞活力、愈合速度、迁移及侵袭程度、Caspase-3/7表达水平,分析NS5ATP13对HepG2细胞增殖迁移的影响;(3)应用Western blot方法从蛋白水平分析NS5ATP13对增殖凋亡相关基因Bax、Bcl-2、N-Cadherin表达的影响,初步探索NS5ATP13作用的机制。3.观察并探讨OMT与NS5ATP13的关系及对HepG2细胞增殖凋亡的影响和作用机制:(1)为进一步了解OMT与NS5ATP13的关系,在HepG2细胞中沉默NS5ATP13后加入OMT;(2)检测细胞活力的变化、愈合速度、迁移及侵袭程度、Caspase-3/7表达水平,分析干扰NS5ATP13后对OMT抑制HepG2细胞增殖的影响;(3)应用Western blot、RT-PCR方法进一步分析OMT与NS5ATP13之间的关系及对HepG2细胞增殖凋亡的影响。4.观察并探讨OMT、NS5ATP13与AKT/GSK/mTOR信号通路的关系:应用Western blot方法检测OMT、NS5ATP13及沉默NS5ATP13后加入OMT后HepG2细胞中AKT/GSK/mTOR信号通路中相关蛋白AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β(Ser9)、mTOR、p-mTOR蛋白的表达,从蛋白水平分析OMT、NS5ATP13与AKT/GSK/mTOR信号通路的关系。结果:1.OMT能够抑制HepG2细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡;2.过表达NS5ATP13能促进HepG2细胞增殖、迁移,沉默NS5ATP13后能促进HepG2细胞凋亡;3.将NS5ATP13沉默后加入OMT,能进一步降低NS5ATP13的表达同时显著抑制HepG2细胞增殖、迁移,诱导细胞凋亡;4.OMT能抑制AKT/GSK/mTOR信号通路;过表达NS5ATP13能促进AKT/GSK/mTOR信号通路,沉默NS5ATP13后能抑制AKT/GSK/mTOR信号通路;将NS5ATP13沉默后加入OMT能进一步抑制AKT/GSK/mTOR信号通路。结论:1.OMT与NS5ATP13对HepG2细胞的增殖凋亡有显著影响,其机制可能与调节HepG2细胞增殖凋亡相关基因表达,影响AKT/GSK/mTOR信号通路,影响线粒体凋亡途径与EMT活化相关;2.OMT能够抑制NS5ATP13的表达,在干扰NS5ATP13的情况下予以OMT干预,能够使NS5ATP13表达进一步减少同时增加对HepG2细胞增殖迁移的抑制作用,说明NS5ATP13可能是OMT作用的靶点之一。