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研究背景肺癌是常见的恶性肿瘤之一。吉西他滨(gemcitabine,GEM)可以抑制DNA合成,其抗肿瘤活性已在临床上得到成功证实。GEM与顺铂(cisplatin,CDDP)的联合治疗,作为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的一线化疗方案,在临床疗效、疾病进展和生存率方面均优于单用CDDP方案。虽然GEM可以有效杀死癌细胞,但许多患者在经历常规疗程化疗后仍面临癌症复发的风险。化疗药物存在多种免疫机制。因此,预防癌症复发最有效的策略可能是调动和刺激免疫系统对抗肿瘤细胞的作用。肿瘤免疫原性的定义是通过各种途径诱导肿瘤产生免疫反应以阻止其生长。在某些抗癌治疗过程中,死亡的肿瘤细胞会释放出免疫调节因子或损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)。这些作为“危险信号”,增加了肿瘤细胞的免疫原性。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)作为内源性危险信号,招募树突状细胞(dendritic cells,DCs)与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)结合,激活T细胞免疫应答。钙网蛋白(calreticulin,CRT)可被化疗药等刺激因素诱导,从内质网腔向细胞膜转移,使细胞膜易于被DCs吞噬。自然杀伤细胞(natural killer cells,NKs)是一种重要的抗病毒和抗癌固有免疫淋巴细胞。NKG2D配体(natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs)属于NKs活化性受体,对于识别和清除肿瘤至关重要。NKG2DLs主要表达于肿瘤细胞,而在健康细胞中表达较低。通过上调NKG2DLs实现增加NKs杀伤活性,可以有效增强抗肿瘤免疫。研究目的本研究拟通过检测不同剂量GEM作用肿瘤细胞后诱导免疫原性的强弱,探讨抗肿瘤机制及疗效,为以GEM为基础治疗免疫功能正常的肺癌患者提供理论依据。研究方法采用免疫荧光法检测接受GEM刺激后LLC细胞和A549细胞免疫原性分子CRT、HMGB1的暴露。Dead染色法检测化疗药刺激LLC细胞和A549细胞后的存活情况。实时定量聚合酶链反应法(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、流式细胞术分别验证GEM刺激LLC细胞和A549细胞后,NKG2DLs的mRNA水平和蛋白水平表达。在体内,构建LLC皮下荷瘤小鼠模型。监测皮下瘤的体积、小鼠的体重。GEM联合CDDP治疗小鼠肿瘤。收获小鼠后用血细胞分析仪分析血常规,用免疫荧光法观察皮下瘤的免疫原性分子CRT、HMGB1的暴露。用流式细胞术研究脾脏免疫细胞及功能分子变化。CFSE(carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester,羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯)实验检测C57BL/6小鼠的脾脏NKs杀伤LLC细胞和GEM预刺激的LLC细胞。RTCA(real-time cellular analysis,实时细胞分析)实验检测化疗药治疗后荷瘤鼠脾脏纯化NKs杀伤未刺激的LLC细胞。肝脏、肾脏H&E染色,比较不同处理后的毒性作用。研究结果免疫荧光实验结果显示GEM刺激可以使LLC细胞和A549细胞的免疫原性分子CRT膜表达、HMGB1的暴露增加。低浓度的GEM相比于高浓度GEM刺激LLC细胞和A549细胞引起更强的CRT和HMGB1暴露。Dead染色观察到高剂量GEM引起更多LLC细胞与A549细胞死亡。qRT-PCR法检测到GEM刺激LLC细胞和A549细胞后诱导NKG2DLs mRNA水平表达上调,流式细胞术显示GEM刺激A549细胞后NKG2DLs的蛋白水平表达上调。体内实验中,免疫荧光法显示低剂量(30 mg/kg)GEM处理后皮下瘤CRT和HMGB1的每平方厘米平均荧光强度(MFI)高于中剂量(60 mg/kg)和高剂量(120 mg/kg)治疗组。低、中、高剂量GEM处理的小鼠血常规淋巴细胞绝对值无明显变化,但淋巴细胞百分比增加。所有化疗组血常规中性粒细胞绝对值和百分比均下降。小鼠脾脏流式细胞术结果显示,低剂量组NKs百分比增加,中、高剂量组未见增加。所有GEM组均检测到NKG2D表达上调。低剂量GEM组NKs功能分子IFN-γ表达增加。高剂量GEM组的Ki67的MFI和百分比与PBS组相比明显下降。CFSE实验结果显示,低剂量GEM刺激的LLC细胞对NKs杀伤更敏感。RTCA结果显示,所有GEM组NKs的细胞毒作用增强。低剂量GEM组的NKs杀伤功能强于中、高剂量两组。所有GEM组对LLC肿瘤的抑制作用显著高于PBS组。所有GEM组对小鼠体重无明显影响。H&E染色显示肝脏组织随着GEM剂量的增加出现空泡变性增加,但未见肾脏过度损伤。研究结论本研究观察到低剂量GEM治疗增加CRT的膜表达和HMGB1的暴露,上调了NKG2DLs的表达,活化NKs,增强抗肿瘤免疫。低剂量GEM治疗对免疫系统无明显毒性,通过增强免疫原性触发抗肿瘤作用。得出了如下结论:1.低剂量GEM可增强肺癌免疫原性分子的暴露低剂量GEM治疗可在体外肺癌细胞和荷瘤小鼠体内增强免疫原性分子CRT的膜表达、HMGB1的暴露。高剂量GEM可导致肺癌细胞死亡。2.GEM可诱导肺癌固有免疫系统相关免疫原性分子的上调GEM可上调人和小鼠肺癌细胞中NKG2DLs的表达,增加NKs抗肿瘤免疫反应。3.低剂量GEM可诱导肺癌小鼠模型中的NKs活化GEM减少小鼠血液中性粒细胞绝对值。低剂量GEM治疗小鼠脾脏NKs功能分子IFN-γ表达增加,高剂量GEM组Ki67下降。低剂量GEM可激活NKs免疫系统,而高剂量GEM则抑制NKs增殖。NKG2D~+NKs表达IFN-γ水平高于NKG2D~-NKs。低剂量GEM治疗可提升肺癌小鼠模型中的NKs免疫应答。4.低剂量GEM治疗的肺癌细胞对NKs杀伤更敏感NKs对低剂量GEM刺激后的LLC的杀伤作用更强。低剂量GEM治疗后的脾脏NKs杀伤肺癌细胞更敏感。GEM对小鼠脾脏NKs的Ki67、NKG2D和IFN-γ的表达无直接影响。5.低剂量GEM抑制小鼠肺癌生长低剂量GEM抑制小鼠肿瘤生长,对小鼠肝、肾组织无明显不良反应。