杨梅(Myrica rubra Sieb. et Zucc)是杨梅科杨梅属水果,喜湿、耐阴寒,为我国主要果树之一。杨梅树皮中含有多酚、黄酮、二芳基庚烷、单宁、三萜等具有多种药理活性的化合物。本文采用人肝癌细胞(HepG2)、人膀胱癌细胞(YTS-1)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)、人前列腺癌细胞(PC-3)等典型的肿瘤细胞株进行体外培养,研究了杨梅树皮提取物和其主要特征性成分(杨梅素、杨梅苷等)的抗癌活性,发现它们普遍具有良好的抑制肿瘤细胞体外增殖的活性和诱导肿瘤细胞凋亡的作用,尤其是杨梅素与杨梅苷联用在PC-3细胞上表现出极显著的协同增效作用,确定了二者配合的最佳比例关系,并对其协同作用机制进行了研究。同时,在B16细胞的试验研究中,杨梅苷表现出可与熊果苷媲美的美白潜力。主要研究结论如下：(1)杨梅树皮醇提物经由正丁醇萃取得到正丁醇分级相(BuE)和水分级相(WaE),分别测定了两相的多酚、总黄酮含量(W/%)。WaE中多酚和总黄酮含量分别为36.01%±0.8148%、33.15%±0.7374%,BuE中的多酚和总黄酮含量分别为61.01%±0.1165%、31.20%+0.7987%。通过DPPH自由基清除实验,结果表明WaE和BuE的半抑制浓度(IC5o)分别为164.8μg/mL、114.8μg/mL。通过高效液相色谱法分析,鉴定BuE中主要成分为杨梅素、杨梅苷和槲皮素,并测得BuE中杨梅素、杨梅苷和槲皮素的含量(W/%)分别为3.75%±0.58%、29.28%±1.27%、6.06%+0.355%,摩尔比为1：5.35：1.7。(2)对人肝癌细胞HepG2的体外抑制试验发现,BuE具有较强的细胞增殖抑制作用。在杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷(1：1摩尔比)三组试样中,杨梅苷的效果最弱。培养24h时,杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷对HepG2内细胞增殖的IC5o分别为841.03μmol/L、1578.13μmol/L、652.79μmol/L;培养48h时,三者的IC5o分别为321.67μmol/L、908.20μmol/L、286.92μmol/L,而同期BuE的IC50为116.54μmol/L;培养72h时,杨梅素与杨梅苷联用的抑制效果略高于单独使用杨梅素(浓度为300μmol/L时抑制率分别为52.88%、48.82%),未表现出显著的协同增效作用,而此时BuE的IC50达到80.05μmol/L;表明杨梅树皮有效成分对HepG2细胞的增殖抑制具有时间依赖关系。同时,通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测,表明三组试样能诱导HepG2细胞的凋亡,并呈现剂量依赖关系；高浓度(300μmol/L)时,杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷的诱导细胞凋亡率分别为38.04%、13.77%、38.67%；杨梅素与杨梅苷联用对细胞的早期诱导凋亡作用较强,单独使用杨梅素则对细胞的晚期诱导凋亡作用较强。(3)对人膀胱癌细胞YTS-1的体外增殖抑制试验表明,培养48h时,杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷的IC50分别为240.10μmol/L、272.05μmol/L、378.82μmol/L;培养72h时,IC50分别为198.95μmol/L、209.15μmol/L、251.06μmol/L,表明三组试样对YTS-1细胞的增殖抑制作用均具有时间依赖性,杨梅素与杨梅苷联用并未表现出协同增效作用。同时,采用PI染色法对YTS-1进行细胞周期检测,发现高浓度(300μmol/L)时,三组试样对YTS-1细胞的G2/M期具有显著的阻滞作用(P<0.01)。另外,在诱导YTS-1细胞凋亡的试验中发现,低浓度(37.5μmol/L)寸三组样品对YTS-1细胞的诱导凋亡作用不强,而高浓度(300μmol/L)时,作用极显著(P<0.01),杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷对YTS-1的诱导细胞凋亡率分别达31.70%、25.50%、25.19%；且杨梅素的早期诱导凋亡作用较强,杨梅素与杨梅苷联用的晚期诱导凋亡作用较强。(4)以公认的天然美白物质熊果苷为阳性对照,对小鼠黑色素瘤细胞(B16)进行细胞增殖抑制试验。发现培养48h时,杨梅素、杨梅苷、熊果苷对B16细胞的IC50分别为131.55μmol/L、138.44μmol/L、154.03μmol/L;培养72h时IC50分别达90.4μmol/L、88.6μmol/L、101.55μmol/L,表现出时间依赖性。同时,通过对B16细胞内酪氨酸酶活性的检测发现,杨梅苷对胞内酪氨酸酶活性的抑制率高达(74.52+3.248)%；对B16细胞内黑色素含量的检测发现,杨梅苷抑制黑色素合成的作用显著；表明杨梅廿的美白效果可与熊果苷媲美。(5)对人前列腺癌细胞PC-3的细胞增殖抑制试验发现,培养48h时,杨梅素、杨梅苷和槲皮素对PC-3细胞增殖的IC50分别为94.48μmol/L、267.1μmol/L、418.25μmol/L,BuE和WaE的IC50则为95.21μmol/L和118.3μmol/L;在研究杨梅素与杨梅苷协同作用试验中,培养48h时,试样浓度75μmol/L的杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷(各自为37.5μmol/L)对PC-3细胞株的增殖抑制率分别为40.53%、13.34%、72.28%,杨梅素和杨梅苷之间具有协同增效作用。采用吖啶橙染色法分析,不同给药浓度的PC-3细胞呈现凋亡样变化,并表现出时间与剂量的依赖关系。通过Annexin V-FITC/PI双染法检测,确认杨梅素和杨梅苷能够诱导PC-3细胞凋亡,且杨梅素的作用更强；杨梅素诱导PC-3细胞晚期凋亡的作用较强,而杨梅苷诱导细胞早期凋亡的作用较强；同时,二者表现出显著的协同增效作用。(6)对杨梅素与杨梅苷在PC-3细胞体外增殖抑制试验中的协同增效作用进行进一步研究,发现杨梅素与杨梅苷对PC-3细胞株的增殖抑制存在时间和剂量依赖关系,培养72h时,杨梅素与杨梅苷联用的作用最强,最佳摩尔浓度比为1：5。通过PI染色法检测PC-3细胞周期,发现杨梅素、杨梅苷都能将PC-3细胞周期阻滞于G0/G1期,且杨梅素与杨梅苷联用对PC-3细胞周期的影响最强,二者的最佳摩尔浓度比为1：5。对PC-3细胞凋亡作用的研究还表明,低浓度时(75μmol/L)杨梅素、杨梅苷的细胞诱导凋亡作用都不强,而在摩尔比为1：5和1：7时诱导细胞凋亡的作用显著(细胞凋亡比例分别为32.00%、33.30%)。和单独使用杨梅苷时的早期诱导凋亡作用较强相比,摩尔比1：7时虽然杨梅苷的比例增加,其晚期凋亡作用却较强,因此可以推断杨梅素与杨梅苷联用时对PC-3细胞的诱导凋亡作用机制被改变。同时,通过TUNEL法进一步分析细胞晚期凋亡表明杨梅素与杨梅苷之间具有显著的协同增效作用,二者摩尔比浓度为1：5和1：7时诱导PC-3细胞晚期凋亡的作用较强。综上所述,杨梅树皮提取物及其特性成分杨梅素和杨梅苷对所试的多种肿瘤细胞株的体外增殖均表明出显著的抑制活性及选择性；尤其是在对PC-3细胞的增殖抑制试验中,杨梅素和杨梅苷表现出显著的协同增效作用,且二者复配的最佳浓度范围与其在杨梅树皮醇提物正丁醇分级相(BuE)中存在的比例关系相吻合,从另一侧面印证了杨梅树皮醇提物正丁醇分级相(BuE)对多种肿瘤细胞的抑制活性优于分离得到的单体化合物,表明杨梅树皮有效成分的抗肿瘤活性是以黄酮类化合物为主导的,且黄酮类化合物之间的协同增效作用值得引起高度关注。本研究结果充分表明,杨梅树皮有效成分在天然抗癌药物、肿瘤防护的功能性食品以及美白护肤品领域具有广阔的应用前景和深入研究的价值。