【摘 要】
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霉菌是丝状真菌的俗称,霉菌污染是坚果质检不合格的主要原因,实现其快速检测对于坚果行业发展具有重要意义,现行国标方法对于霉菌的检测需要7天时间,严重制约了行业快速发展。其中曲霉属、青霉属和镰刀菌属是坚果霉菌污染的主要污染菌群。近年来分子生物学技术和时间分辨荧光分析技术的快速发展,为食品安全检测提供了重要依据和创新手段,然而在霉菌检测领域的应用还较少,本研究采用水热法等方法制备了几种纳米材料,结合分子
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霉菌是丝状真菌的俗称,霉菌污染是坚果质检不合格的主要原因,实现其快速检测对于坚果行业发展具有重要意义,现行国标方法对于霉菌的检测需要7天时间,严重制约了行业快速发展。其中曲霉属、青霉属和镰刀菌属是坚果霉菌污染的主要污染菌群。近年来分子生物学技术和时间分辨荧光分析技术的快速发展,为食品安全检测提供了重要依据和创新手段,然而在霉菌检测领域的应用还较少,本研究采用水热法等方法制备了几种纳米材料,结合分子信标q PCR技术、荧光共振能量转移技术和环介导等温扩增技术（LAMP）构建了一系列快速、灵敏和操作简便的霉菌检测方法。首先,根据曲霉属、青霉属和镰刀菌属的内转录间隔区基因序列设计引物及3对特异性分子信标探针,建立一种同时检测坚果中曲霉属、青霉属和镰刀菌属的多重实时荧光定量PCR的方法。对q PCR反应体系进行优化,得到良好的扩增曲线和标准曲线,该方法对曲霉属的最低检出限为2.5×10-2 ng/m L（741 CFU/g）,青霉属最低检出限为8.7×10-3 ng/m L（500 CFU/g）,镰刀菌属最低检测为5.6×10-3 ng/m L（454 CFU/g）,为坚果中霉菌的检测提供了一种快速准确的方法。相对于国标检测方法需要耗时7天,本文所建立方法用时仅为3天。其次,合成了两种具有时间分辨荧光特性的KYF4:Ln3+（Ln=Tb,Eu）纳米材料（TRNPs）和具有高效荧光淬灭性能的GO/Fe3O4磁性纳米材料。通过将曲霉属霉菌和青霉属霉菌分子信标修饰TRNPs构建荧光探针,建立了基于双色时间分辨荧光材料和GO/Fe3O4荧光共振能量转移同时检测曲霉属霉菌和青霉属霉菌的方法。通过优化实验条件,曲霉属霉菌基因检测线性范围为2.5 nmol/L～50 nmol/L（y=106.24x-80.07,R~2=0.9367）,检测限为0.91 nmol/L（477 CFU/g）;青霉属霉菌基因检测线性范围为2.5nmol/L～50 nmol/L（y=160.46x-203.49,R~2=0.9940）,检测限为1.21 nmol/L（634 CFU/g）。将本方法用于实际坚果样品中进行检测,结果与平板涂布法一致,验证了本方法在实际样品中的检测具有可行性。最后,合成了具有双发射荧光的FITC@Au NCs纳米材料,根据曲霉属28S r RNA基因序列设计3对引物,建立一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器结合LAMP测定曲霉属霉菌的方法。将牛血清白蛋白（BSA）保护的Au NCs作为参考荧光信号,荧光素-异硫氰酸酯（FITC）作为p H的响应信号。当体系中存在靶标核酸时,LAMP反应带来的体系中p H的下降,从而引起比率荧光值的下降。曲霉属霉菌基因检测线性范围为10-3 ng/m L～10~3 ng/m L（y=-0.12x+5.15,R~2=0.9696）,检测限为7.4×10-3 ng/m L（481CFU/g）。
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