目的构建携带单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因（herpes simplex virus 1-thymidine kinase，HSV1-tk）的重组腺病毒载体（Ad5-tk）并将其转染动物心肌，通过在体放射性自显影（autoradiography，ARG）及单光子发射计算机断层（single photon emission computedtomography，SPECT）显像研究探讨用氟-碘阿糖基脲嘧啶(¹³¹I-2’-fluoro-2’-deoxy-1-β-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil，¹³¹I-FIAU)作为报告探针，用HSV1-tk作为报告基因心脏显像的可行性，并探讨显像所需病毒滴度及显像的时间过程，为此报告系统应用于人类的心脏报告基因显像提供理论基础。方法1．重组腺病毒的构建及鉴定以含巨细胞病毒（CMV）启动子的pDC316为载体质粒，将报告基因HSV1-tk插入多克隆位点，构建重组质粒pDC316-tk,以pDC316-tk作为重组穿梭质粒，与腺病毒（Adenovirus，Ad）骨架质粒共转染293细胞，包装生成腺病毒重组体Ad5-tk,本部分与北京本元正阳公司合作完成。2．¹³¹I-FIAU的标记及质量鉴定利用Iodogen固相氧化法对FAU进行碘化标记，标记产物用Sep-Pak C-18反相层析色谱小柱进行纯化及标记率分析，TLC-SG硅胶板薄层层析法测定标记产物的放射化学纯度，并观察¹³¹I-FIAU在37℃新鲜正常人血清中放置4h、12h和24h后的体外稳定性。3．大鼠心肌报告基因表达的放射性自显影SD大鼠心肌内注射Ad5-tk。根据目的不同进行分组如下：①转染报告基因后时间对显像的影响：心肌内转染1×10⁸pfu Ad5-tk后第1、2、3、5、7d注射¹³¹I-FIAU。②不同转染滴度对显像结果的影响：心肌内注射不同滴度的Ad5-tk （5×10⁸ pfu,1×10⁸pfu,5×10⁷ pfu,1×10⁷pfu），2d后注射¹³¹I-FIAU。对照组均采用注射同体积的空载腺病毒（Ad5-null）。所有动物在注射¹³¹I-FIAU 24 h后断颈法处死，取出心脏，测量γ计数值，行ARG研究，RT-PCR和免疫组织化学分别从mRNA水平和蛋白水平证实HSV1-tk基因表达，并对ARG图像和RT-PCR图像行半定量分析，探讨体内ARG图像上ROI的T/NT与体外γ计数及基因表达的mRNA水平间的相关性，寻求获得最佳图像的转染滴度及基因表达时间。4．家兔心肌报告基因表达的SPECT显像家兔心肌内注射Ad5-tk，根据目的不同进行分组如下：①转染报告基因后不同时间对显像结果的影响：家兔心肌内注射不同滴度的Ad5-tk （1×10⁹pfu,5×10⁸ pfu,1×10⁸pfu,5×10⁷ pfu,1×10⁷pfu），2d后耳缘静脉注射¹³¹I-FIAU 600μCi，于注射后6h、24h、48h和72h行心肌SPECT显像，注射1×10⁹pfu Ad5-tk的家兔继续行96h和120h显像；②不同Ad5-tk滴度对显像结果的影响：家兔心肌注射不同滴度的Ad5-tk（1×10⁹pfu,5×10⁸ pfu,1×10⁸ pfu,5×10⁷ pfu,1×10⁷pfu），2d后耳缘静脉注射¹³¹I-FIAU 600μCi行6h、24h和48h心肌SPECT显像。对照组均采用注射同体积的无菌生理盐水。第二组动物显像结束后处死，取出心脏，测量γ计数值，行RT-PCR及免疫组织化学研究，对SPECT和RT-PCR图像行半定量分析，并对各半定量指标间的相关性进行分析，寻求活体内获得SPECT报告基因表达显像所需转染病毒的最佳剂量及获得最佳图像质量的时间过程。结果1．重组腺病毒的构建及鉴定与本元正阳公司协作构建的重组质粒pDC316-tk经PCR、酶切鉴定和测序鉴定证明序列正确，包装生成的重组腺病毒Ad5-tk的物理滴度（v.p./ml）为1．1×10¹²，感染滴度（TCID50/ml）达到1．6×10¹⁰。2．¹³¹I-FIAU的标记及质量鉴定Iodogen固相氧化法能有效标记FAU；标记产物用Sep-Pak C-18反相层析色谱小柱进行纯化并测得的标记率为（53．82±2．05）％（n=5），TLC-SG硅胶板薄层层析法测定标记产物的放射化学纯度为（94．85±1．76）％（n=5），¹³¹I-FIAU在37℃血清中放置4h、12h和24h后的放射化学纯度大于90％。3．大鼠心肌报告基因表达的放射性自显影结果从ARG图像上可见，局部转染Ad5-tk的大鼠前侧壁心肌部位的¹³¹I-FIAU浓聚，非转染部位和对照组心肌未见¹³¹I-FIAU浓聚。在第一组实验中，局部心肌最高的放射性活性出现在第一天，随着时间-放射性活性逐渐减弱。尽管HSV1-tk基因表达可见于甚至基因转染后第7天，最佳的图像质量出现在转染后的第1～2天。第二组实验中，转染的心肌中¹³¹I-FIAU浓聚的水平呈典型的Ad剂量依赖性。从ARG分析和γ计数中可见，Ad5-tk的阈值为5×10⁷ pfu，考虑病毒的免疫反应，最佳的Ad5-tk滴度为1×10⁸ pfu。两组实验中均显示ARG图像上感兴趣区（Region of interest，ROI）所得的半定量结果与体外的γ计数及RT-PCR分析的mRNA水平间存在较好的相关性（第一组时间因素相关系数分别为R²=0．9899，P＜0．01和R²=0．954，P＜0．01；第二组滴度因素相关系数分别为R²=0．9954，P＜0．01和R²=0．9621，P＜0．01），γ计数和RT-PCR间亦存在较好的相关性（时间因素：R²=0．9697，P＜0．01；滴度因素：R²=0．9508，P＜0．01）。4．家兔心脏报告基因表达的SPECT显像SPECT图像上可见转染Ad5-tk心肌前侧壁部位¹³¹I-FIAU的浓聚，而对照组显示为本底信号。RT-PCR和免疫组织化学分别在mRNA和蛋白水平证实了注射部位HSV1-tk基因的表达。第一组实验中SPECT图像上于转染后的3天均可见局部心肌¹³¹I-FIAU的浓聚，第四天时¹³¹I-FIAU浓聚较少，第五天时不见¹³¹I-FIAU的浓聚。局部心肌的最高的放射性活性可见于6 h的图像，然后随着时间延长其活性逐渐下降。对于不同的病毒滴度，均可见转染后1～2天图像质量最好。第二组实验对不同病毒滴度的研究中可见，转染的心肌中¹³¹I-FIAU浓聚水平呈典型的Ad剂量依赖性。从SPECT分析和γ计数中可见，显像的Ad5-tk阈值为5×10⁷ pfu，最佳滴度为1～5×10⁸ pfu。半定量分析显示，SPECT图像上ROI的T/NT与体外γ计数的％ID/g及RT-PCR分析的mRNA水平间存在较好的相关性（相关系数分别为R²=0．933，P＜0．01；R²=0．877，P＜0．01）。结论本研究证实了以腺病毒作为载体，HSV1-tk作为报告基因，放射性核素标记FIAU作为报告探针心脏报告基因SPECT显像的可行性。SPECT图像及ARG图像上ROI的T/NT结果与体外的γ计数的％ID/g及RT-PCR分析的mRNA水平间存在较好的相关性。显像所需最佳的病毒滴度为1～5×10⁸pfu，最佳的显像时间为基因转染后1～2天。因此，HSV1-tk/FIAU显像心脏的转基因表达是可行的，可以无创的指导心脏疾病的基因治疗，为人类的心脏报告基因显像提供了理论基础。