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研究背景和目的无限制的增殖、血管新生以及基因组不稳定是肿瘤细胞最典型的特点,肿瘤细胞经历许多代谢改变以适应加快的增殖速率和营养物质消耗,但代谢重编程使肿瘤细胞处于较高水平的活性氧环境中,为防止肿瘤细胞因活性氧过度堆积引起死亡,肿瘤细胞需要重编程还原当量稳态的代谢过程,并以此来保证细胞内有足够的谷胱甘肽等还原性物质及时清理致死的活性氧。磷酸戊糖途径是细胞内重要戊糖代谢途径,交通糖和核苷酸间的代谢,为细胞的增殖保障核糖供给。除此之外,经氧化磷酸戊糖途径释放的还原当量-NADPH,广泛参与细胞内的代谢合成反应,并维持着胞内环境中的谷胱甘肽和巯基酶的还原状态,在多种肿瘤组织中被报道磷酸戊糖途径的代谢活跃,因此普遍认为磷酸戊糖途径代谢对肿瘤的转化和进展是必不可少的。6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Glucose-6-phosphate Dehydrogenase,G6PD）是氧化磷酸戊糖途径的第一步限速酶,催化6-磷酸葡萄糖氧化并生成6-磷酸葡萄糖醛酸内酯,同时产生NADPH。传统观点认为,G6PD是合成细胞胞质内NADPH的主要来源,既为肿瘤细胞合成脂质提供还原力原料,也参与维持细胞内谷胱甘肽的还原稳态。因此,G6PD的酶活性被认为对肿瘤的发生进展具有重要促进作用。然而,近期本课题组利用3号碳位D标记的葡萄糖体外培养HeLa等肿瘤细胞发现,在乏氧和抑制线粒体呼吸链的刺激下肿瘤细胞流向磷酸戊糖途径的葡萄糖速率明显减慢,而肿瘤细胞的线粒体功能常常发生异常以及肿瘤组织常缺血缺氧等特点,提示经G6PD酶活性生成的NADPH,对于肿瘤细胞演变进化过程中抵抗氧化应激的意义,可能并没有传统观点认为那般绝对的重要。因为在肿瘤细胞中,存在诸如苹果酸脱氢酶（Malic Enzyme,ME）、异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydrogenase,IDH）和亚甲基四氢叶酸脱氢酶（Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase,MTHFD）等代偿生成NADPH的循环反应,同样可以帮助细胞维持还原性谷胱甘肽的相对稳态,并且这些酶被报道在多种肿瘤组织中对维持细胞内还原稳态有重要意义。另外,临床上存在一种G6PD酶功能缺陷的基因遗传病—蚕豆病,表现为误食蚕豆或者服用磺胺类药物后引起溶血,可以解释为在红细胞中G6PD是产生NADPH的唯一来源,当红细胞受到氧化刺激后,红细胞膜被活性氧破坏而发生溶血。然而蚕豆病患者可以经受胚胎发育后存活,而敲除G6PD的基因小鼠却发生胚胎致死,即G6PD酶活性的缺陷对生物个体胚胎发育并没有那么重要,而其蛋白本身对胚胎发育是至关重要,这同样给我们一个提示—G6PD蛋白可能存在重要的非PPP活性功能,这些功能对生物的胚胎发育和存活至关重要。为明确G6PD酶活性在肿瘤细胞内的具体作用和生理病理意义以及探索G6PD存在的其他潜在功能,本课题基于通过CRISPR-Cas9技术建立的敲除G6PD的肿瘤细胞系,并参考G6PD缺乏症患者的基因表型,回补建立包含野生型、天然突变型和人工位点突变型G6PD的研究模型,观察和研究敲除G6PD后肿瘤细胞的一系列表型变化,明确G6PD酶活性和本身蛋白对肿瘤细胞的抵抗氧化应激刺激的功能意义;并从肿瘤细胞的代谢方面,联合利用转录组学和代谢组学的研究方法,揭示G6PD影响最相关的代谢改变,深入研究G6PD蛋白在肿瘤发生和进展过程中影响细胞能量稳态与存活命运的具体机制,旨在揭示G6PD蛋白本身的未知一面,为揭示胚胎发育和肿瘤发生发展的提供了新方向和思路。研究方法和结果研究方法1、通过CRISPR-Cas9技术建立敲除G6PD的单克隆HeLa、MDA-MB-231和HCT116肿瘤细胞系,并利用Western Bloting和或基因组序列测序验证G6PD敲除成功;2、在HeLa、MDA-MB-231和HCT116敲除G6PD的单克隆细胞系中回补wtG6PD和酶活性缺陷或缺失的G6PD,并确立关于G6PD酶活性和蛋白本身功能的研究模型;3、以HeLa细胞为研究代表模型,利用转录组RNAseq测序和非靶向代谢质谱技术,研究KO G6PD、wtG6PD和酶活性缺陷G6PD（G6PD-R257G）细胞各自之间的相似性和差异性,揭示G6PD酶活性和G6PD蛋白本身最相关的信号和代谢通路改变;4、以HeLa细胞为研究代表模型,利用药物刺激或者改变培养环境,给予KO G6PD、wtG6PD和酶活性缺陷G6PD（G6PD-R257G）细胞以双氧水、乏氧和抑制线粒体呼吸链阻断等刺激,观察这三个细胞对各种刺激的反应及其细胞相应的代谢改变,如糖酵解、谷氨酰胺代谢、NADH和NADPH稳态等;5、以HeLa细胞为研究代表模型,利用稳定同位素标记培养和LC-MS质谱检测技术,对KO G6PD、wtG6PD和酶活性缺陷G6PD（G6PD-R257G）细胞内PPP、糖酵解、柠檬酸循环、脂肪酸合成、NADH/NAD+和NADPH/NAD+等代谢流进行研究;6、以HeLa细胞为研究代表模型,利用LC-MS靶向脂质代谢组学质谱检测技术,对KO G6PD、wtG6PD和酶活性缺陷G6PD（G6PD-R257G）细胞内的脂质代谢物进行研究;7、以HeLa细胞为研究代表模型,利用药物或者工具酶的表达,对敲除G6PD后肿瘤细胞对各种刺激敏感致死的具体机制进行研究;8、以HeLa细胞为研究代表模型,深入研究细胞AMPK信号通路与抗氧化和能量代谢稳态之间的关系。结果1、成功构建HeLa、MDA-MB-231和HCT116敲除G6PD的单克隆肿瘤细胞系,并回补wtG6PD和一系列酶活性缺陷G6PD,发现肿瘤细胞敲除G6PD后对双氧水、乏氧和线粒体呼吸链阻断等刺激敏感并快速致死;2、G6PD（R257G）蛋白表现为oxPPP活性缺失,但它仍可以帮助细胞很好地抵抗氧化、乏氧和线粒体呼吸链阻断等刺激,而且G6PD（R257G）与wtG6PD细胞内的多种重要代谢表型并没有明显差异,但同时G6PD（R257G）细胞又具有其独特的一些代谢特点;3、敲除G6PD后肿瘤细胞内的NADPH/NADP+比值明显降低,而NADH/NAD+比值明显升高,利用药物或者工具酶降低KO G6PD细胞内的NADH/NAD+比值,可升高其内的NADPH/NADP+比值,并营救细胞对各种氧化刺激引起的快速死亡;4、敲除G6PD后肿瘤细胞内的糖酵解代谢增加,且具有线粒体功能障碍的细胞代谢表型,进一步阻断线粒体呼吸链后,肿瘤细胞不能继续有效增加糖酵解并引起细胞坏死,而利用药物刺激恢复KO G6PD细胞内的糖酵解可部分逆转细胞对双氧水和线粒体呼吸链阻断等刺激引起的快速死亡;5、敲除G6PD后肿瘤细胞内谷氨酰胺的还原性羧化途径被抑制,而代偿性的葡萄糖-丙酮酸-苹果酸-柠檬酸-乙酰辅酶A代谢途径增加;6、利用CRISPR-Cas9技术联合敲除IDH1/2,阻断谷氨酰胺的还原性羧化途径可升高细胞内的NADH/NAD+比值,在此基础上抑制AMPK信号通路,减少葡萄糖的糖酵解代谢,可以引起肿瘤细胞出现类似KO G6PD在阻断线粒体呼吸链时出现的细胞死亡;7、敲除G6PD后肿瘤细胞对激活AMPK的刺激应答调节异常,AMPK激活后对能量稳态的维持,可以部分逆转KO G6PD细胞对双氧水和线粒体呼吸链阻断等刺激引起的快速死亡;8、利用AKB降低KO G6PD细胞内NADH/NAD+比值后,可明显刺激KO G6PD细胞内的AMPK信号激活。结论1、敲除G6PD的肿瘤细胞对双氧水、乏氧和AntiA刺激相当敏感,可发生快速地细胞坏死。G6PD（R257G）细胞内的oxPPP的酶活性缺失或极低,但它可以很好地逆转肿瘤细胞在双氧水、乏氧和AntiA刺激下发生的快速坏死,同时G6PD（R257G）可以恢复多种与wtG6PD细胞一致的重要代谢表型。除此之外,G6PD（R257G）细胞又具有其独特的一些代谢特点。G6PD蛋白本身对肿瘤细胞抵抗各种氧化应激同样重要,这种功能与G6PD或者其他关键酶通过产生NADPH而维持还原稳态的机制完全不同;2、肿瘤细胞在敲除G6PD后出现线粒体电子传递链障碍的表现,如果再进一步给予影响线粒体功能的刺激,将引起细胞发生快速坏死,但通过药物或者工具酶降低NADH/NAD+细胞内的比值,则可以逆转KO G6PD在AntiA刺激下发生的快速坏死,并且G6PD蛋白这种维持NADH/NAD+稳态的功能不依赖于其合成NADPH的酶活性;3、一般地,肿瘤细胞在乏氧或者抑制线粒体呼吸链功能后,将通过大量增加糖酵解和谷氨酰胺的还原性羧化来应对能量和还原力不足,但肿瘤细胞在敲除G6PD后,谷氨酰胺的还原性羧化不能被刺激增加,而且糖酵解的增加需要AMPK信号的激活,而敲除G6PD的肿瘤细胞响应AntiA刺激下AMPK信号的激活明显变慢,以及葡萄糖向丙酮酸转化过程净升高NADH/NAD+比值将会反馈抑制葡萄糖向丙酮酸转化的,最终将导致细胞因ATP合成不足而引发快速坏死;4、肿瘤细胞在敲除G6PD后并不影响细胞葡萄糖向脂肪酸的代谢转换,但明显抑制谷氨酰胺向脂肪酸的代谢转换,追溯乙酰辅酶A的来源发现,敲除G6PD肿瘤细胞内葡萄糖可以通过丙酮酸-苹果酸-柠檬酸-乙酰辅酶A的方式代偿补充细胞内的乙酰辅酶A,而经谷氨酰胺-a-酮戊二酸-异柠檬酸-柠檬酸-乙酰辅酶A的代谢通路被抑制;5、肿瘤细胞联合敲除IDH1/2后同样可明显升高细胞内NADH/NAD+比值,虽然联合敲除IDH1/2对AntiA刺激不敏感,但如果再联合抑制AMPK信号的激活,则可模拟敲除G6PD细胞出现的细胞快速坏死,提示前述KO G6PD细胞出现的快速坏死与AMPK的响应应答抑制和谷氨酰胺的还原性羧化的同时抑制密切相关,而这中间的关键环节很可能是NADH稳态维持和能量供应;6、肿瘤细胞内谷氨酰胺的还原性羧化与细胞内NADH/NAD+稳态维持具有重要联系,而且阻断谷氨酰胺的还原性羧化将通过改变NADH/NAD+比值影响肿瘤细胞对AMPK信号激活的调节。