胃癌的发生、浸润、转移是一个多基因、多阶段、多水平综合作用及多种信号通路参与的过程。随着分子生物学理论和技术的发展,人们对肿瘤发生、发展过程的有了更深刻的认识,认为对肿瘤进行分子靶向治疗将成为主流手段。CXCL12,也称为基质细胞衍生因子-1,既往研究证明CXCL12仅有CXCR4一个受体,CXCL12与CXCR4协同作用,可以对肿瘤浸润、转移和耐药性进行调控,但CXCR4和CXCL12的表达量在不同恶性肿瘤中并不平行。人们深入研究后发现,在氨基酸保守序列方面,趋化因子受体CXCR7与CXCR4基因序列高度相似。CXCR7高表达于乳腺癌、肾癌、肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤原发灶中,但是在胃癌组织中CXCR7的表达情况鲜有研究。本课题将从三方面探讨CXCR7与胃癌的关系:1、研究CXCR7-CXCL12生物学轴在人胃癌中的表达情况,分析其与胃癌病理分期与分级的关系;同时为后续实验筛选高表达CXCR7的人胃癌细胞株;2、筛选有效的CXCR7-shRNA序列,并构建以慢病毒为载体的CXCR7-shRNA;转染Lv-CXCR7-shRNA至人胃癌细胞株,从mRNA和蛋白的表达水平,癌细胞的增殖及侵袭性能力变化等方面验证转染后的干扰效果,探讨CXCR7对胃癌细胞生.物学行为的影响;3、验证CXCR7-shRNA对分化抑制因子(ID-1)的抑制作用,研究CXCR7-CXCL12生物学轴调控ID-1对胃癌移植瘤及血管生成的影响。本课题研究内容分为下三个部分:第一部分CXCR7/CXCL12在不同胃癌组织中的表达及与临床病理因素的关系研究目的:探讨人胃癌组织和正常中CXCR7和CXCL12基因的表达情况,并分析CXCR7和CXCL12的表达与腹膜转移、淋巴结转移、肝脏转移等临床病理因素的相互关系,同时对4种人胃癌细胞系中的CXCR7 mRNA表达情况进行分析,为胃癌诊断和治疗中的潜在价值提供理论依据。研究内容:1免疫组化方法检测2015年5月至2016年5月在锦州医科大学附属第一医院胃外科通过手术切除的103例患者的胃癌组织及正常对照组织中的CXCL12和CXCR7表达,半定量分析其表达结果;2培养并传代SNU-1、SGC7901、BGC-823,和NCI-N87四种胃癌细胞株,对四种细胞的生长情况进行观察;RT-PCR检测四种细胞中CXCR7 mRNA表达情况;3根据CXCR7与CXCL12在胃腺癌中表达的染色强度与阳性细胞数对该生物学轴中两种蛋白的表达进行Spearman相关分析,同时分析其蛋白表达与临床病理数据之间的关系。研究结果:1 CXCR7和CXCL12在胃腺癌细胞的细胞质和/或细胞膜分别呈强染色和中到强染色。CXCR7和CXCL12在正常胃粘膜中分别呈无染色和中等强度染色。在两组间CXCR7、CXCL12染色强度存在统计学意义(P<0.05);2 CXCR7蛋白仅在2例正常组织中呈现弱表达趋势(2/103),而在胃癌组织中CXCR7的阳性表达率显著高于正常组织,具有统计学意义(P<0.05);CXCR7蛋白在89例胃癌组织中呈现阳性染色(89/103),其中,CXCR7蛋白在67例淋巴转移癌中呈现阳性染色(67/71),在18例肝转移癌中呈现阳性染色(18/19),在14例腹膜转移癌中全部呈现阳性染色(14/14),染色阳性率分别为86.41%、94.37%、94.74%和100%,其中,C组和D组之间相比,无显著性差异(P=0.227);其余各组间相比,均具有显著性差异(P<0.05);3 CXCL12蛋白在64例正常组织中表达(64/103),阳性染色率为62.14%。在胃癌组织中CXCL12蛋白的染色阳性表达率显著高于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05);CXCL12蛋白在86例胃癌组织中表达(86/103),阳性染色率高达83.50%,CXCL12蛋白在57例淋巴转移癌中表达(57/71),在13例肝脏转移癌中表达(13/19),在8例腹膜转移癌中表达(8/14),阳性染色率分别为80.28%、68.42%和57.14%,组间相比,均具有显著性差异(P<0.05);4 CXCR7和CXCL12在胃腺癌原发灶的表达与肿瘤组织形态(P均<0.01)和浸润深度(P均<0.05;进展期>早期)相关、与淋巴结(P均<0.01)、肝脏(P均<0.01)和腹膜(P均<0.01)转移相关、与肿瘤侵袭血管(P均<0.01)和淋巴管(P均<0.01)程度相关,而与肿瘤位置(P>0.05)、大小(P>0.05);患者年龄(P>0.05)、性别(P>0.05)无关;5 CXCR7与CXCL12在胃腺癌原发灶中的表达存在正相关性,胃腺癌原发灶中二者的表达趋于一致(r=0.611,P<0.05);6 CXCR7 mRNA在4株细胞株中的2株(SGC7901和BGC-823细胞株)中高表达,而在SNU-1和NCI-N87细胞株中低表达。研究结论:1本研究发现,在胃癌组织中CXCR7/CXCL12的表达水平显著高于正常胃黏膜组织,CXCR7/CXCL12的表达与胃癌发生、增殖及生长过程紧密相关;2随着胃癌疾病进程的推进,CXCR7的表达水平与胃癌原发灶通过血行和淋巴结开始转移,突破胃壁浆膜层向腹腔内种植转移过程.早.正相关,说明胃癌细胞中CXCR7的表达可能对肿瘤的转移产生促进作用;3伴随胃癌的进展和转移,CXCR7/CXCL12的表达逐渐上调。提示CXCR7/CXCL12在胃腺癌原发灶中的表达趋于一致,且二者阳性高表达的胃癌细胞可能具有更强的侵袭性和转移性;该生物轴也很可能成为协同胃癌发生、进展(侵袭、转移)并推测预后优劣的重要分子标记;4本研究检测CXCR7 mRNA在4种胃癌细胞株中的表达,证实有的细胞株不表达或低表达、有的则高表达CXCR7mRNA。胃癌细胞株SGC7901能够高表达CXCR7,可以作为下一步研究的实验对象。第二部分慢病毒载体介导的RNAi沉默CXCR7后对人胃癌细胞株SGC7901靶向抑制的实验研究研究目的:设计并构建由慢病毒介导的CXCR7-shRNA表达载体,将其转染人胃癌细胞SGC7901,利用RNA干扰技术对高表达的CXCR7基因进行特异性靶向抑制后,检测SGC7901细胞的生物学功能,为胃癌CXCR7靶向治疗开辟新思路。研究内容:1 CXCR7-shRNA-1慢病毒载体的构建与包装,利用荧光倒置显微镜对慢病毒包装效果进行观察,同理包装CXCR7-shRNA-2、CXCR7-shRNA-3以及阴性对照,利用终点稀释实验法对病毒滴度进行测定;2检测携带目的基因的慢病毒的最佳感染指数;3将上述三组慢病毒病毒液和对照组以最佳感染指数转染人胃癌细胞SGC7901,分析表达载体的沉默效率,将沉默效率最高的慢病毒病毒干扰序列作为后续试验对象;4 MTT检测SGC7901细胞增殖,并绘制生长曲线;5 Western blot测定CXCR7蛋白表达效率;6 Transwell侵袭实验定量分析迁移的细胞数量,计算沉默CXCR7对人胃癌细胞侵袭的抑制率。研究结果:1三组慢病毒载体pSilencer~TM4.1-CXCR7-shRNA和阴性对照构建成功,病毒滴度测定为:CXCR7-shRNA-1:3.28×10~8TU/ml;CXCR7-shRNA-2:4.15×10~8 TU/ml;CXCR7-shRNA-3:3.84×10~8 TU/ml;阴性对照:2.73×10~8 TU/ml,均符合慢病毒RNAi实验要求,可将其用于后续转染实验。2与对照组(D组)相比,在A、B、C三个实验组中的CXCR7mRNA表达量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);其中,与B、C实验组相比,CXCR7-shRNA-1转染组(A组)可以明显降低CXCR7mRNA表达量,差异有统计学意义(P<0.05),说明CXCR7-shRNA-1组(A组)可以显著抑制胃癌细胞SGC7901的CXCR7 mRNA的表达,因此,选择慢病毒载体CXCR7-shRNA-1作为后续实验;3未转染病毒组(B组)以几何倍数增长,而经慢病毒载体干扰后,实验组(A组)中细胞增殖速度显著下降,从第24 h开始,在每个时间段与B组的差距都具有统计学意义(P<0.05),证明载慢病毒载体CXCR7-shRNA-1的十扰下,可以明显抑制CXCR7基因表达,减缓胃癌SGC7901细胞的增殖速度;4在慢病毒载体CXCR7-shRNA-1的十扰下,与对照组和空白组相比,实验组(A组)细胞的CXCR7蛋白表达明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05),而对照组和空白组相比,两者之间无显著性差异(P>0.05);5慢病毒载体CXCR7-shRNA-1转染48 h后,实验组(A)穿膜的细胞数量为97.35±7.49,而空白组(B)穿膜的细胞数量高达253.92±26.13,实验组(A)穿膜的细胞数量低于空白组(B),且具有统计学意义(P<0.05),实验组(A)穿膜的细胞抑制率为61.66%,提示当通过慢病毒转染对SGC7901细胞中CXCR7的表达进行抑制,可以显著抑制SGC7901细胞向远处的侵袭能力。研究结论:1成功构建可以有效沉默CXCR7基因的重组慢病毒载体CXCR7-shRNA,鉴定并测定沉默效率。2筛选沉默效率最高的CXCR7-shRNA-1组作为后续实验。3重组慢病毒载体CXCR4-shRNA能够显著抑制胃癌细胞SGC7901的CXCR7mRNA和蛋白的表达及增殖能力。第三部分CXCR7-shRNA调控ID-1对胃癌移植瘤及血管生成的影响研究目的:通过建立胃癌裸鼠原位移植瘤模型,对重组慢病毒载体CXCR7-shRNA对胃癌细胞SGC7901细胞浸润转移能力的影响进行分析,同时对CXCR7-shRNA对细胞凋亡与肿瘤微血管生.成的影响进行探讨,为临床应用提供理论依据,同时为胃癌侵袭转移的防治提供新思路。研究内容:1建立原位移植瘤裸鼠动物实验模型,对各项指标进行观测:体重与腹水情况;原位移植瘤重量和体积;裸鼠生存时间、生存率及抑瘤率;2实验分组:采取抽签法将将24只实验动物进行随机分组,共分为3组,每组8只。阴性对照组(A组):单独转染SGC7901组;阳性对照组(B组):转染携带空病毒载体的SGC7901组;实验组(C组):转染携带CXCR7-shRNA慢病毒载体的SGC7901组;3免疫组织化学检测瘤体样本,采用Weidner微血管计数法测定肿瘤细胞的微血管密度;4 Western Blot 检测 CXCR7、ID1 及 VEGF 蛋白表达;5透射电镜检测瘤组织凋亡情况。研究结果:1三组荷瘤裸鼠成瘤时间一般在8-15天,最长为24天;生存时间在25-44天之间;在重组慢病毒CXCR7-shRNA转染14天后,可在裸鼠左上腹部扪及质地较硬、活动性较差的肿瘤结节,大小在2-3 cm之间,随着肿瘤结节不断扩大,转染24天后,可在裸鼠左上腹部扪及明显的肿瘤包块,肿瘤结节大小在同一组裸鼠之间略有不同,但差异不显著;2实验组裸鼠肿瘤结节出现在接种约18天后,在接种26天后瘤生长速度明显减慢,腹腔内各器官肿瘤包块均为小结节,且数量较少;而阳性对照组裸鼠肿瘤结节出现在接种约12天后,在接种20天后可观察腹腔内各器官肿瘤包块明显,对该组裸鼠进行腹腔和胸腔解剖发现:膈、肺上没有观察到肿瘤结节,而腹腔中的腹膜、肠系膜、肝、肾、脾脏、肠均出现明显的肿瘤组织,且形状不同、大小不一;而阴性对照组裸鼠在接种约8天后,就可在左上腹部术区周围观察到质地较软的肿瘤结节,伴随肿瘤结节不不断扩大,在接种18天后在裸鼠右上腹部可触及各器官肿瘤包块明显,此时,裸鼠明显消瘦,活动能力明显下降;3对裸鼠腹腔转移瘤进行病理学观察发现:肿瘤组织呈卵圆形,大小在1.16 mm-5.45 mm之间,灰白色,质地较软,切面呈鱼肉状。肿瘤细胞为腺样结构,形状、大小和排列顺序均呈不规则形态,肿瘤细胞染色质和核浆较为丰富,核大深染,核分裂像较为普遍,呈浸润性生长、细胞分化性较差,与周围组织没有明确的分界;4重组慢病毒CXCR7-shRNA转染7大后,对裸鼠进行腹腔穿刺,实验组平均在26.67天开始出现腹水,腹水量平均为2.45 ml;阳性对照组平均在18.54天开始出现腹水,腹水量平均为5.89 ml;阴性对照组平均在16.29天开始出现腹水,腹水量平均为6.62 ml。实验组腹水产生时间明显延后且腹水量少,差异有统计学意义(P<0.01),但在水的产生时间及腹水量方面,阳性对照组和阴性对照组之间不存在统计学差异(P>0.05);5对三组裸鼠解剖标本的腹腔脏器进行观察发现,小鼠腹腔内存在5-10ml血性腹水;实验组裸鼠胃、肝脏、肠及肠系膜、脾、肾、腹膜的成瘤率依次为100%、37.5%、37.5%、25%、25%、12.5%、25%;阳性对照组裸鼠胃、肝脏、肠及肠系膜、脾、肾、腹膜的成瘤率分别为100%、87.5%、87.5%、75%、75%、62.5%、75%;阴性对照组裸鼠成瘤率接近100%,肿瘤结节普遍分布在胃、肝脏、肠及肠系膜、脾、肾、腹膜中。实验组与另外两组对比,成瘤率差异具有统计学意义(P<0.01)。两组对照组之间相比,无显著性差异(P>0.05);6对三组裸鼠解剖标本进行肉眼观察发现:肿瘤结节色灰白,质地较韧,呈卵圆形向器官表面突出,直径从绿豆到米粒大小不等,均为孤立结节,肿瘤结节大部分分布在肠系膜和肠管中,少量分布在肝脏、肾脏、脾脏中,分别生长在肝门、肾盂区域和脾门上,但都未侵及实质,还有部分质地较软的肿瘤结节分布在被膜上,呈灰红色,触之不易出血;7对三组死亡裸鼠解剖后的原位肿瘤外观进行分析发现,实验组中肿瘤结节较少,而阳性对照组与阴性对照组肿瘤结节色淡红且质地较硬,呈不规则形向外突出;8实验组腹腔转移瘤最大长径和最小短径分别为2.06 mm和1.16mm,转移瘤数量平均为8.5个,肿瘤最大重量量为0.51 g,转移瘤重量平均为1.34g;阳性对照组腹腔转移瘤最大长径和最小短径分别为5.36mm和2.06mm,转移瘤数量平均为40.25个,肿瘤最大重量为1.13g,转移瘤重量平均为3.93g;阴性对照组腹腔转移瘤最大长径和最小短径分别为5.45mm和2.05mm,转移瘤数量平均为42.75个,肿瘤最大重量为1.16g,转移瘤重量平均为4.20g。两组对照组相比在肿瘤数、肿瘤长短径及重量上没有显著差异(P>0.05)。在裸鼠腹腔转移肿瘤大小、数量及重量方面,实验组与另外两组对比均早现显著差异(P<0.01)。实验组的抑瘤率为68.15%,阴性对照组的抑瘤率为6.4%,两者之前差异具有统计学意义(P<0.05);9实验组裸鼠的平均存活41.75天,比阳性对照组的26.50天和阴性对照组的24.88天均延长15-17天;实验组裸鼠在第28天死亡一例,第28天还存活裸鼠7只,存活率为87.5%;阳性对照组裸鼠在第24天死亡一例,第28天还存活裸鼠2只,存活率为25%,阴性对照组裸鼠在第23天死亡一例,第28天仅存活裸鼠1只,存活率为12.5%。在裸鼠存活率方面,与阳性对照组和阴性对照组相比,实验组的裸鼠存活率显著提高,差异具有统计学意义(P<0.01)。实验组和阳性对照组比阴性对照组的生命延长率提高了 40.4%和6.1%;10各组之间微血管密度的差异有统计学意义(P<0.01),实验组肿瘤血管的抑制作用较明显,MVD为11.38±1.25,分别与阴性对照组、阳性对照组之间MVD比较的差异有统计学意义(P<0.05),两组对照组MVD分别为20.17±1.33和23.73±2.40,之间MVD比较没有统计学意义(P>0.05);11实验组CXCR7蛋白表达水平明显受到抑制,与两组对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01),而两组对照组之间无明显差异(P>0.05),抑瘤率为72.54%,表明沉默CXCR7基因可以显著抑制肿瘤的生成与转移,该结果与利用肿瘤体积计算的抑瘤率68.15%的结果吻合;12实验组中ID1蛋白表显著降低,与对照组相比差异具有统计学意义(P>0.05),两组对照组之间没有显著性差异(P>0.05)。VEGF蛋白表达同样与两组对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);13实验组的裸鼠细胞内的粗面内质网由于出现轻度扩张而出现脱颗粒现象,而线粒体发生髓样化现象、细胞内含核碎裂块,这些现象说明实验组细胞已经发生典型的凋亡现象;而对照组细胞线粒体膜缺损,大量嵴消失、线粒体发生髓样化现象,粗面内质网由于出现高度扩张而出现脱颗粒现象、胞质水肿有变性坏死的现象,说明对照组细胞仅发生变性坏死,并没有典型的凋亡现象发生。研究结论:1本文成功建立了胃癌裸鼠原位移植瘤模型;2重组慢病毒载体CXCR7-shRNA可以对腹水产生进行有效抑制,明显降低肿瘤组织的生长速度,减小肿瘤组织体积、减轻肿瘤组织的重量,对癌细胞向不同腹腔器官的转移过程进行抑制,此外还可以明显降低死亡率、延长裸鼠的生存时间;3 CXCR7-shRNA重组慢病毒载体对ID-1的表达进行抑制,部分阻断肿瘤血管新生过程,促进肿瘤细胞凋亡,最终发挥抑制肿瘤生长和转移的作用。