【摘 要】
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黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase,XOD）是人体内次黄嘌呤和黄嘌呤代谢产生尿酸的关键酶。植物多酚具有良好的生物活性和安全性,能够抑制黄嘌呤氧化酶,减少尿酸合成进而缓解痛风症状。因此从植物多酚中筛选出对XOD抑制效果较好的多酚单体,并制备能同时结合多种多酚单体的安全性高的复合物,对痛风患者的症状缓解具有重要的意义。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-LG）被广泛应用作为活
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黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase,XOD）是人体内次黄嘌呤和黄嘌呤代谢产生尿酸的关键酶。植物多酚具有良好的生物活性和安全性,能够抑制黄嘌呤氧化酶,减少尿酸合成进而缓解痛风症状。因此从植物多酚中筛选出对XOD抑制效果较好的多酚单体,并制备能同时结合多种多酚单体的安全性高的复合物,对痛风患者的症状缓解具有重要的意义。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-LG）被广泛应用作为活性物质的载体,并且在人体内可以抵抗胃蛋白酶的消化,因此多酚单体通过与β-LG结合能够顺利地运送至肠道被小肠吸收,然后释放多酚发挥其活性作用。本研究以多酚单体白藜芦醇（Resveratrol,RES）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）和橙皮苷（Hesperidin,HES）为主要研究对象,选择β-LG作为与配体结合的载体,研究了多酚单体对XOD的抑制动力学、抑制效果与抑制机制,多酚与β-LG的结合机制,β-LG-三配体复合物对XOD的抑制效果。主要研究方法及结果如下:（1）首先利用紫外分光光度法对比了六种常见且生物活性较强的多酚单体对XOD的抑制效果,最终筛选出三种多酚——EGCG、白藜芦醇和橙皮苷,计算其对XOD的抑制动力学,通过荧光猝灭实验结合分子对接模拟研究了多酚单体与XOD的结合机制。EGCG、白藜芦醇和橙皮苷在室温下的半数抑制浓度(IC50)分别为68.99μg/m L、59.62μg/m L和59.27μg/m L,Lineweaver-Burk双倒数作图结果表明它们为黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂。EGCG、白藜芦醇和橙皮苷与XOD结合导致使酶的内源荧光发生猝灭,猝灭机制为静态猝灭,并且三种多酚能与XOD的氨基酸残基结合,抑制黄嘌呤氧化酶的活性。（2）采用分子荧光、傅里叶红外、圆二色谱、超高效液相色谱、分子对接模拟等揭示了β-LG与多酚单体的结合机制。分子荧光光谱的结果表明EGCG、白藜芦醇和橙皮苷通过静态机制猝灭了蛋白荧光,傅里叶红外光谱与圆二色谱的结果表明,多酚单体能够通过增加β-折叠和减少β-转角结构改变β-LG的二级结构,对β-LG的α-螺旋和无规则卷曲的含量影响不大。超高效液相色谱结果表明多酚单体与β-LG相互作用形成在室温和加热条件下稳定的β-LG-单配体复合物,分子对接模拟结果证实,EGCG、白藜芦醇和橙皮苷主要以氢键与疏水相互作用稳定地结合在β-LG的中央疏水腔内及疏水表面。（3）通过分子荧光光谱法研究了多酚单体对β-LG-单配体复合物溶液荧光光谱的影响,确定了β-LG-三配体复合物的加样顺序为橙皮苷、EGCG、白藜芦醇,用分子对接软件Auto Dock4.2和Py MOL模拟了其结合机理,最后通过紫外分光光度法检测β-LG-多酚复合物对XOD的抑制效果,得出β-LG-橙皮苷单配体复合物,β-LG-橙皮苷-EGCG二配体复合物和β-LG-橙皮苷-EGCG-白藜芦醇三配体复合物的总IC50分别为132.52μM、68.29μM和41.32μM,最终β-LG-三配体复合物的抑制效果约是橙皮苷单体的7倍,EGCG单体的11倍,白藜芦醇单体的19倍。基于β-LG-多酚复合物对XOD具有较好的抑制效果,其在天然活性成分的开发利用、降尿酸功能性食品和膳食补充剂的应用中具有很好的前景。
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