蛋白质作为细胞生物功能的执行者主要取决于它们的三维结构,其中既包括天然折叠的结构蛋白,也有缺乏稳定结构的固有无序蛋白。不同的蛋白可以实现细胞不同的生理过程,蛋白质三维结构的解析有助于阐明蛋白质行使功能的分子机制。因此,蛋白质结构研究一直是生命科学领域中的一个重要部分。蛋白质与配体的相互作用是细胞实现特定功能的基础。蛋白质-配体相互作用作为细胞内一种极其重要的生物分子活动参与细胞周期的各个生物学过程,诸如信号传导、能量代谢、基因调控、酶催化、免疫反应等过程均伴随着相关蛋白质与底物、配体或小分子的结合。蛋白质-配体相互作用及其组成的作用网络的研究不仅有助于我们认识生命活动的分子机制,同时对临床疾病的诊断和治疗也具有重要意义。核磁共振波谱作为研究蛋白质结构和与其它生物分子相互作用的重要方法,特别是对溶液中蛋白质的研究独具优势。本论文选取了三个蛋白一人源蛋白GAS7-SH3,羊驼纳米抗体Nb26(两者均为天然折叠蛋白)和人源蛋白TGIF1-RD2(预测为内源性无序蛋白)作为研究对象,基于核磁共振波谱方法并结合其它生物物理和生物化学方法对它们的结构与功能展开研究,具体的研究结果如下:1.人源蛋白GAS7-SH3结构解析与特异性多肽配体的筛选。人源GAS7基因可以表达三种GAS7亚型蛋白,其中只有GAS7c的N端包含SH3结构域。目前为止,GAS7-SH3结构域的结构和功能仍不清楚。我们解析了 GAS7-SH3蛋白的液体核磁结构,发现GAS7-SH3的结构为典型的SH3蛋白折叠模式,即包含5个β折叠以及1个310螺旋。结构和序列比较表明GAS7-SH3与ABL-SH3结构域在结构上高度相似。ABL-SH3通过传统方式与富含脯氨酸的多肽P41高亲和力结合,结合区域包括两个疏水口袋和RT-loop区的一个特异性位点。然而与ABL-SH3不同的是,NMR滴定显示GAS7-SH3蛋白中只有RT-loop区的6个残基以及两个疏水口袋附近的2个残基发生了明显的化学位移扰动,这表明GAS7-SH3与P41的亲和力较低,并且属于非典型的结合模式。此外,利用噬菌体展示文库筛选的4个多肽配体与GAS7-SH3的结合也较弱,其与GAS7-SH3的结合区域也主要位于RT-loop。本研究表明GAS7-SH3虽然具有典型的SH3折叠模式,但可能具有独特的配体结合特异性。2.人源蛋白TGIF1-RD2(256-401)的同源寡聚作用及其识别辅阻遏蛋白SIN3A-PAH2的分子机制研究。人源转化生长相互作用因子TGIF1是细胞分化必不可少的调节蛋白,本课题组前期对TGIF1的特异性DNA结合结构域HD的结构与功能关系进行了深入研究。本论文则聚焦于TGIF1-RD2(256-401)结构域的结构和功能研究,其可以与多种蛋白质相互作用,以介导TGIF1作为“枢纽”蛋白参与细胞多种信号通路。本文通过重组表达成功制备了 TGIF1-RD2(256-401)蛋白样品。结构研究表明TGIF1-RD2(256-401)在溶液中为内源无序性蛋白,但其碳端的376-401区间含有一定比例的α螺旋结构。酵母双杂交表明TGIF1-RD2(256-401)在细胞内的同源寡聚作用主要由376-401氨基酸之间的区域介导,F379、L381、L382、V385和L387残基对其同源寡聚至关重要。同时,TGIF1-RD2(256-401)蛋白的 376-401 区间对于 TGIF1-RD2(256-401)与SIN3A-PAH2的相互作用是必需的。核磁滴定和突变显示TGIF1-RD2(256-401)碳端的疏水残基F379、L382和V385是与SIN3A-PAH2相互作用的关键位点。上述研究表明TGIF1-RD2(256-401)碳端的376到401区间对其同源寡聚作用以及与SIN3A-PAH2的相互作用均至关重要,并且介导两种相互作用的关键残基也高度一致。TGIF1-RD2(256-401)的同源寡聚作用与SIN3A-PAH2的相互作用是否存在竞争以及这两种生物学功能之间的深度联系还有待进一步研究。3.纳米抗体Nb26识别黄曲霉毒素AFB1的分子机制研究。纳米抗体作为目前最小的抗原结合实体,因其在生物技术应用中的便利性而受到越来越多的关注。近年来,许多纳米抗体与蛋白质抗原结合的结构模型得到了很好的表征,但关于识别小分子半抗原的纳米抗体结构研究较少。我们解析了特异性识别小分子半抗原AFB1的纳米抗体Nb26的液体磁结构,Nb26整体结构呈典型的抗体重链可变区(VHH)折叠模式。荧光和核磁滴定表明Nb26与AFB1有较高的亲和力,Nb26的FR2和CDR3区对AFB1的识别尤为重要,这暗示了一种新颖的结合模式。以上研究为进一步开发和改造半抗原特异性的纳米抗体功能提供了有用的结构信息。综上所述,本论文基于液体核磁共振对GAS7-SH3、TGIF1-RD2(256-401)以及纳米抗体Nb26的结构和其与特异性配体的相互作用进行了研究。GAS7-SH3结构解析和配体筛选研究揭示了 GAS7-SH3虽然属于典型的SH3折叠模式,但可能表现出非典型的多肽配体结合模式,这加深了对GAS7蛋白功能机制的理解。TGIF1-RD2(256-401)的同源寡聚以及识别辅阻遏蛋白SIN3A-PAH2的分子机制研究加深了对TGIF1作为细胞信号网络“枢纽”蛋白的分子机理的理解,并为相关疾病的诊断和药物研发提供结构基础。Nb26识别AFB1的分子机制研究揭示了一种新颖的识别小分子半抗原的结合模式,为后续Nb26的功能改造提供了分子层面上的指导。